Titel Promotor Affiliaties "Korte inhoud" "Genoom en transcriptoom editing met CRISPR/Cas als precisie therapie voor de ziekte van Charcot-Marie-Tooth type 2L." "Vincent Timmerman" "Perifere Neuropathieën" "Patiënten met de ziekte van Charcot-Marie-Tooth (CMT) hebben een erfelijke motorische en sensorische neuropathie met een lengte-afhankelijke degeneratie van hun perifere zenuwen als gevolg. De meeste patiënten hebben een duplicatie op chromosoom 17, wat resulteert in een hogere expressie van het perifere myeline proteïne 22 (PMP22). Pogingen tot het reduceren van PMP22 expressie hebben geleid tot de recente ontwikkeling van een therapie. Echter, het hoge aantal zeldzame mutaties in meer dan 90 verschillende genen bemoeilijkt de ontwikkeling van effectieve therapeutische strategieën voor een aanzienlijke groep CMT-patiënten. In dit TOP-project willen we gebruik maken van de CRISPR/Cas-technologie om selectief een mutant transcript te elimineren of zelfs te corrigeren. Als ""proof-of-concept"" zullen we deze technologie richten op een dominante missense mutatie in het ""small heat shock protein"" HSPB8. Deze mutatie veroorzaakt een axonaal subtype van CMT. Resultaten uit eerder onderzoek toonden aan dat een volledige deletie van dit gen in een muismodel enkel geassocieerd is met milde (subklinische) symptomen. Dit verschaft een therapeutisch venster waar specifieke eliminatie van het mutant allel kan leiden tot verbetering van het fenotype. We zullen een ""proof-of-principle"" uitvoeren door CRISPR/Cas9 te introduceren via het adeno-geassocieerd virus (AAV) om selectief het mutant allel in vivo te inactiveren. Vervolgens zullen we onderzoeken of dezelfde specificiteit kan verkregen worden met CRISPR/Cas13b die RNA-moleculen selectief kan afbreken en daardoor het risico op het introduceren van permanente ""off-target"" effecten kan voorkomen. Vervolgens zullen we met Cas13b gekoppelde ""base editors"" onderzoeken of men de mutant transcripten kan herstellen tot het wild type allel. Deze in vivo muisexperimenten zullen worden aangevuld met onderzoek in motorneuronen, die bekomen werden door middel van differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), afkomstig van patiënten cellen. Met deze geavanceerde genoom- en transcriptoom editing willen we het potentieel van deze methode onderzoeken voor patiënten met perifere neuropathieën die niet met de huidige geneesmiddelen kunnen worden behandeld." "GEn Therapie INnovatie Training Netwerk" "Rik Gijsbers" "Moleculaire Virologie en Gentherapie, Respiratoire Aandoeningen en Thoraxheelkunde (BREATHE)" "In de afgelopen tien jaar hebben gen- en celtherapeutische toepassingen zich ontwikkeld van een vage, ambitieuze hoop tot een klinische realiteit voor een paar zeldzame ziekten, waarbij de eerste werkelijke ziekteveranderende behandeling werd geboden. Het idee dat mensen die lijden aan genetische aandoeningen kunnen worden genezen door een gezonde DNA-sequentie in cellen in te brengen, werd voor het eerst geopperd door Friedmann en Roblin in 1972. Meer recent werden de gentherapie-concepten uitgebreid met gene silencing en gene editing technologie. Glybera was de eerste recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren (rAAV) gebaseerde gentherapie op de EU-markt (goedgekeurd in 2012). Deze behandeling werd echter in 2017 van de markt gehaald vanwege de hoge productiekosten. De recente EMA-goedkeuring van de CAR-T-celbehandelingen Kymriah en Yescarta, Luxturna voor de behandeling van een zeldzame vorm van aangeboren blindheid, en Zolgensma voor de behandeling van spinale musculaire atrofie, toont aan dat het veld evolueert naar een meer commerciële fase, vergelijkbaar met het keerpunt in het domein van de antilichamen op het einde van de jaren 1990. Cel- en gentherapieën zijn immers niet langer alleen maar het terrein van kleine biotechbedrijven, nu ook grote farmaceutische bedrijven, die vaak nogal afkerig staan tegenover risico's, in gentherapie investeren en het vakgebied overnemen. Momenteel zijn er wereldwijd meer dan 3500 gentherapieën en celtherapieën in ontwikkeling, waarbij de nadruk vooral ligt op oncologische indicaties, gevolgd door zeldzame ziekten. Vandaag zijn er wereldwijd meer dan 20 gentherapieën goedgekeurd, en verwacht wordt dat dit aantal met 10-20 nieuwe cel- en gentherapieproducten per jaar zal toenemen tegen 2025.Hoewel er oprechte belangstelling bestaat en venturebedrijven, CDMO's en big pharma miljarden investeren, moeten nog verschillende belangrijke technologische hindernissen worden overwonnen voordat het volledige potentieel kan worden gerealiseerd. Verdere ontwikkeling, met name voor veelvoorkomende indicaties, wordt momenteel belemmerd door (1) een beperkte productieschaal voor genvectoren, met een klinische vraag die groter is dan de huidige productiecapaciteit, (2) moeilijkheden met standaardisatie en kwaliteitscontrole, (3) beperkingen bij in vivo gentherapie en de delivery routes (vermijden van off-target effecten en immuun reacties), alsook (4) een gebrek aan gehumaniseerde modellen voor evaluatie van veiligheid en werkzaamheid.GET-IN zal deze uitdagingen aanpakken mbv baanbrekende innovaties in virale vectorproductie, experimenteel ontwerp, quality-by-design, digital-twin simulaties, CRISPR genoommanipulatie en organoid-on-chip engineering, waarbij 10 doctoraatskandidaten worden opgeleid als de volgende generatie gentherapie vernieuwers en onderzoeksleiders in zowel de industrie als de academische wereld ." "Kanker tijdens de zwangerschap: lange termijn follow-up van de neuropsychologische en gedragsmatige ontwikkeling van kinderen die voor de geboorte werden blootgesteld aan chemo- en/of radiotherapie" "Frédéric Amant" "Gynaecologische Oncologie, Klinische Psychologie" "Kanker tijdens de zwangerschap komt voor bij 1 op 1000 zwangerschappen. De prevalentie neemt toe doordat vrouwen hun kinderwens vaker uitstellen en kanker meer frequent is op hogere leeftijd. In meer dan de helft van de gevallen gaat het om borstkanker of een hematologische kanker. De beslissing om al dan niet te starten met een kankerbehandeling tijdens de zwangerschap noodzaakt een zorgvuldige afweging van de voordelen voor de moeder en de nadelen voor het kind. Een van de belangrijkste bezorgdheden is de mogelijke blootstelling van de foetus aan diagnostische beeldvorming, operaties, chemotherapie, radiotherapie en de daarbij horende stress, met mogelijke schadelijke effecten voor het kind. Door een gebrek aan evidentie over de gevolgen van prenatale blootstelling aan een kankerbehandeling stelden artsen zich in het verleden echter vaak weigerachtig op tegenover het starten van een kankerbehandeling tijdens de zwangerschap. Dit leidde tot het uitstellen van de behandeling van de moeder tot na de geboorte, het afbreken van de zwangerschap of een premature geboorte. Bovendien kan een kankerdiagnose tijdens de zwangerschap beschouwd worden als een emotionele uitdaging voor de toekomstige ouders. Op dit moment is er een gebrek aan kennis over de bezorgdheden en stress die deze vrouwen en hun partners ervaren, hoe zij hiermee omgaan en welke patiënten en partners risico lopen op het ervaren van hoge niveaus van stress.Dit onderzoeksproject focust zich daarom op twee onderzoekslijnen. In de eerste onderzoekslijn onderzochten we de effecten van prenatale blootstelling aan kanker en kankerbehandeling van de moeder op de cognitieve ontwikkeling tijdens de peutertijd en vroege kleutertijd (1.5-3 jaar) en op de cognitieve ontwikkeling en het gedrag in de vroege kindertijd (6 jaar) en in de midden-kindertijd (9 jaar). De resultaten werden vergeleken met deze van een controlegroep van kinderen die geboren werden na een ongecompliceerde zwangerschap en die één-op-één gematcht werden aan de studiekinderen voor land, testleeftijd, zwangerschapsduur bij geboorte, en in de cohort van 6-jarigen en 9-jarigen ook voor geslacht en taal van de testen.Tijdens de peutertijd en vroege kleutertijd (op de leeftijd van 1.5-3 jaar) werden 129 kinderen geïncludeerd waarvan de moeder kanker had tijdens de zwangerschap, samen met 129 controlekinderen. De kinderen werden onderzocht aan de hand van een cognitieve ontwikkelingstest (Bayley Scales of Infant (and Toddler) Development – tweede of derde editie) op de leeftijd van 1.5 en/of 3 jaar. De resultaten toonden aan dat de cognitieve ontwikkeling niet significant verschilde tussen de studiegroep en de controlegroep. Ook in subgroep analyses per type van behandeling (geen behandeling, enkel een operatie, chemotherapie of radiotherapie) of per type van chemotherapie (anthracyclines, taxanen of platinum-gebaseerde therapie) werden geen significante verschillen gevonden tussen de studiegroep en de controlegroep, hoewel voorzichtigheid bij de interpretatie geboden is gezien sommige subgroepen zeer klein waren.Tijdens de vroege kindertijd (op de leeftijd van 6 jaar) includeerden we 132 kinderen die geboren werden na een kankerdiagnose tijdens de zwangerschap, samen met 132 controlekinderen. Er werd een uitgebreid neuropsychologisch onderzoek afgenomen, dat bestond uit een intelligentietest, enkele aandachts- en geheugentesten en een vragenlijst omtrent gedragsproblemen die door de ouders werd ingevuld. Uit de resultaten bleek dat de groepen niet significant verschilden wat betreft Performaal IQ,  verwerkingssnelheid, alertheid, selectieve aandacht, verdeelde aandacht, responsinhibitie, verbale en visuospatiale geheugenspan, verbaal werkgeheugen, korte en lange termijngeheugen voor visuospatiale informatie en gezichten, en het voorkomen van internaliserende en externaliserende gedragsproblemen. De kinderen uit de studiegroep scoorden echter lager op Totaal IQ (5 IQ punten verschil) en Verbaal IQ (8 IQ punten verschil) dan de controles, hoewel hun resultaten zich binnen de normale grenzen bevonden. In een subgroep analyse bij kinderen die aan chemotherapie werden blootgesteld in vergelijking met hun gematchte controles vonden we dezelfde verschillen en gelijkenissen terug.In de midden-kindertijd (9 jaar) includeerden we 43 kinderen die prenataal werden blootgesteld aan kanker van de moeder, samen met 43 controlekinderen. Zij werden uitgenodigd voor een uitgebreid neuropsychologisch onderzoek, dewelke een intelligentietest, verschillende aandachts- en geheugentesten en een gedragsvragenlijst omvatte. Op geen enkele van de testen werden significante verschillen gevonden tussen de groepen. De studiegroep en de controlegroep behaalden dus gelijkaardige resultaten wat betreft Totaal IQ, Verbaal IQ en Performaal IQ, verwerkingssnelheid, alertheid, volgehouden aandacht, selectieve aandacht, verdeelde aandacht, aandachtscontrole, responsinhibitie, verbale en visuospatiale geheugenspan, verbaal werkgeheugen, verbale proactieve en retroactieve interferentie, verbaal en visuospatiaal korte en lange termijngeheugen en het korte en lange termijngeheugen voor gezichten. Ook het aantal internaliserende en externaliserende gedragsproblemen dat door de ouders gerapporteerd werd, was niet significant verschillend tussen de beide groepen. Omwille van de relatief kleine steekproef werden geen subgroep analyses uitgevoerd per type van behandeling.Het is intussen duidelijk geworden dat een kankerbehandeling tijdens de zwangerschap voor specifieke kankertypes en onder welbepaalde omstandigheden mogelijk is. Uit onze drie cohort studies bleek dat de cognitieve ontwikkeling van kinderen op de leeftijd van 1.5 tot 3 jaar, 6 jaar en 9 jaar in het algemeen als normaal kan worden beschouwd in vergelijking met kinderen die geboren werden na eenzelfde zwangerschapsduur. Het Totaal IQ en het Verbaal IQ waren echter significant lager in de studiegroep dan in de controlegroep op de leeftijd van 6 jaar, hoewel deze zich binnen de normale grenzen bevonden en deze verschillen niet werden teruggevonden in onze tussentijdse analyse op de leeftijd van 9 jaar. Verder onderzoek in grotere steekproeven en met een langere follow-up tot op volwassen leeftijd is nodig om de evolutie van deze bevindingen verder te evalueren en na te gaan of er verschillen zijn in impact tussen de verschillende soorten van kankerbehandelingen op de longitudinale ontwikkeling van specifieke cognitieve functies.In de tweede onderzoekslijn onderzochten we de impact van een kankerdiagnose en –behandeling tijdens de zwangerschap op de psychologische stress en het gebruik van cognitieve coping strategieën bij zwangere vrouwen en hun partners. In onze studie vulden 61 patiënten en hun partners retrospectief (70.5%, na de bevalling) of prospectief (29.5%, tijdens de zwangerschap) de ‘Cognitive Emotion Regulation Questionnaire’ (CERQ) en de nieuw opgestelde ‘Cancer and Pregnancy Questionnaire’ in. Uit de resultaten bleek dat zwangere vrouwen die gediagnosticeerd werden met kanker en hun partners gelijkaardige niveaus van bezorgdheden en stress ervaren omtrent de gezondheid van het kindje, de ziekte en behandeling en de zwangerschap en bevalling. We identificeerden drie subtypes van patiënten en partners in het gebruik van cognitieve coping strategieën om om te gaan met hun kankerdiagnose en –behandeling: 48.3% van de vrouwen en partners hanteerde voornamelijk positieve coping strategieën (accepteren, zich concentreren op andere positieve zaken, de situatie op een positieve manier herinterpreteren en relativeren), 32.8% gebruikte hoofdzakelijk internaliserende coping strategieën (piekeren, catastroferen, zich concentreren op planning, zichzelf en anderen de schuld geven, een gebrek aan acceptatie en zich weinig concentreren op andere positieve zaken) en 18.9% gaf voornamelijk zichzelf en anderen de schuld van de situatie. Patiënten en partners die hoofdzakelijk internaliserende coping strategieën gebruikten ervaarden de hoogste niveaus van bezorgdheden en stress en kunnen baat hebben bij bijkomende psychosociale ondersteuning. Echter, vrouwen en partners die vooral een schuldige zochten voor de situatie rapporteerden de laagste niveaus van bezorgdheden en stress. Ontkenning en vermijding van emoties kunnen hierbij een onderliggend mechanisme zijn, waardoor deze groep vrouwen en partners minder klachten rapporteert. Daarnaast is het mogelijk dat andere manieren van emotieregulatie, zoals fysiologische processen (bv. hartslag, ademhaling, spierspanning), sociale processen (bv. het uitdrukken van gevoelens, afleiding zoeken), gedragsmatige processen (bv. zich terugtrekken, roepen, huilen, informatie zoeken) en andere bewuste en onbewuste cognitieve processen (bv. selectieve aandacht, projectie) ook een rol spelen, naast de cognitieve emotieregulatie processen die in deze studie onderzocht werden. Verder onderzoek kan zich toeleggen op de validatie van de nieuw opgestelde ‘Cancer and Pregnancy Questionnaire’ in een prospectieve steekproef zodat deze gebruikt kan worden als een screeningtool in de psychosociale zorg voor vrouwen met kanker tijdens de zwangerschap en hun partners." "RNA gentherapie in een model van RNA-Based Gene Therapy in een model van het syndroom van Usher" "Catherine Verfaillie" "Stamcel- en Ontwikkelingsbiologie" "Usher syndroom is de meest voorkomende oorzaak van gecombineerde doof- en blindheid in mensen. USH is gecategoriseerd in drie verschillende subtypes, gebaseerd op de graad van gehoorverlies en de aanwezigheid van vestibulaire disfunctie. Het gehoorverlies, als gevolg van mutaties in verschillende USH genen, wordt veroorzaakt door de desorganisatie van de bundels van cochlaire haarcellen. In alle drie de USH subtypes wordt de visuele beperking veroorzaakt door retinitis pigmentosa (RP). Mutaties in USH2A is de meest voorkomende oorzaak van USH en de recessieve vorm van RP. In vivo gen editie, gebruikmakend van programmeerbare nuclei zoals CRISPR/Cas9 technologie, biedt een  oplossing door precieze reparatie van het gen in plaats van het bezorgen van een genetisch gecorrigeerd groot cDNA molecuul. Dit project heeft als doel om gen reparatie uit te voeren, in zowel het in vitro als het dieren model van USH2, door het bezorgen van de 'CRISPR tool' aan de fotoreceptoren via nanodeeltjes." "Doelgerichte aanpassing van het PSIP1 gen coderend voor LEDGF/p75 beschermt cellen tegen HIV infectie." "Rik Gijsbers" "Switch Laboratorium (VIB-KU Leuven), Moleculaire Virologie en Gentherapie, Adaptieve Immunologie" "Gentherapie heeft de laatste jaren getoond dat het een behandeling, en soms genezing, kan voorzien voor ziekten die anders onbehandelbaar of zeer moeilijk te behandelen zijn. De ontdekking Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), de ontrafeling van het mechanisme achter het CRISPR-gebaseerde prokaryote adaptieve immuunsysteem (CRISPR-associated system, Cas) en het omvormen van dit systeem tot een efficiënt gene editing platform, heeft gezorgd voor een omwenteling in de moleculaire biologie en het ontwikkelen van verbeterde en nieuwe gentherapiën. Het gebruiksgemak en de flexibiliteit van het CRISPR/Cas9 nuclease systeem heeft geleid tot toepassingen in bijna alle onderzoeksdomeinen in de biologie, zoals de ontwikkeling van cel-gebaseerde modellen, ontrafelen van ziektemechanismen, identifcatie van specifieke doelwitten, het genereren van transgene diermodellen en planten, en het moduleren van transcriptie. Het humaan immunodeficiëntie-virus (HIV) maakt gebruik van cellulaire co-factoren om zijn infectie cyclus succesvol af te ronden. Interfereren met deze co-factoren is een effectieve manier om cellen te beschermen tegen HIV infectie, zoals werd aangetoond bij de natuurlijk voorkomende CCR5del32 mutaties en ablatie van CCR5 met behulp van Zn-vinger nucleases. Een van de toepassingen voor CRISPR/Cas9 is het sleutelen aan immuuncellen in de strijd tegen HIV/AIDS.LEDGF/p75 is een cellulaire co-factor, gecodeerd door het PSIP1 gen, die door het lentivirale integrase (IN) eiwit als deel van het HIV pre-integratie complex gebruikt wordt om zich te hechten aan het chromatine van de geïnfecteerde cel waardoor integratie vergemakkelijkt. LEDGF/p75 depletie resulteerd in defectieve HIV replicatie. In de cel functioneert LEDGF/p75 als verankering voor cellulaire eiwitten en hun respectievelijke proteïne-complexen met het gastheer genoom. Naast CRISPR KO, onderzochten we plaats-specifieke editing van het PSIP1 locus met behulp van CRISPR, waarbij het codon voor aspartaat op position 366 veranderd werd in asparagine (D366N). HIV IN kan niet binden aan LEDGF D366N, terwijl de cellulaire functie van LEGDF/p75 niet geaffecteerd wordt. In de resulterende LEDGF D366N cellen toonden we aan dat HIV-IN niet langer bond, terwijl de interactie met cellulaire bindingspartners onveranderd bleef. Zoals bij LEDGF/p75 knock-out cellen, was er geen HIV replicatie in LEDGF D366N cellen, gedeeltelijk omwille van de verminderde HIV integratie. De provirussen die toch nog integreerden onder deze condities vertoonden een verwaarloosbare of geen transcriptionele activiteit.Deze resultaten onderstrepen het potentieel van plaats-specifieke CRISPR/Cas9-gemedieerde knock-in om cellen te beschermen tegen virale infectie, en tonen aan dat mutatie van LEDGF/p75 een additionele strategie is die gebruikt kan worden om patiënt-afgeleide T-cellen te beschermen tegen HIV-1 infectie als onderdeel van een cell-gebaseerde therapie." "CMOS-gebaseerd multi-electrode rooster voor ruimtelijk gecontroleerde single-cell gen-verandering en observering" "Liesbet Lagae" "Fysica van Zachte Materie en Biofysica, Moleculaire Virologie en Gentherapie, Translationeel Cel- en Weefselonderzoek" "Ik zal een nieuwe CMOS micro-elektrode array-chip (MEA) gebruiken voor het monitoren en genetisch wijzigen van cellen op eencellig niveau. Ten eerste zal ik impedantiemetingen en celafbeelding gebruiken om celtypen te identificeren met verschillende functionele eigenschappen (bijvoorbeeld proliferatiesnelheid, impedantiekarakteristieken) van heterogene glioblastoma-modellen. Ten tweede zal ik lokaal cellen elektroporeren om ze fluorescerend te taggen en hun genoom genetisch te bewerken, terwijl ze hun oncogene potentieel observeren. Experimenten zullen worden geleid door en aangevuld met modellerings- en simulatiebenaderingen om een dieper inzicht te krijgen in de fysieke basis die ten grondslag ligt aan de empirische waarnemingen. Ik koos voor glioblastoma (GBM) als een modelsysteem voor het begrijpen van factoren die elektroporatie en monitoring van één cel beïnvloeden. GBM is de meest agressieve hersenkanker bij volwassenen en is grotendeels ongeneeslijk. GBM vertoont aanzienlijke cel-tot-celvariatie, wat een belangrijke bijdrage levert aan complicaties bij diagnose en behandeling. Behandelingsopties blijven beperkt en inefficiënt, meestal als gevolg van de aanwezigheid van resistente subpopulaties van tumorcellen. De functionele eigenschappen en de klinische relevantie van elk van deze subtypes blijven grotendeels ondergewaardeerd, deels omdat geschikte technologieën om heterogene celpopulaties te bestuderen ontbreken. Ik geloof dat onze geavanceerde CMOS MEA dit probleem kan oplossen. Indien succesvol, zal deze technologie ons op unieke wijze in staat stellen om functionele heterogeniteit van cellen in kanker op te helderen, leidend tot betere behandelingsopties." "Gentherapie voor de behandeling van zeldzame erfelijke aritmogene cardiomyopathie" "Pascal Borry" "Interfacultair Centrum voor Biomedische Ethiek en Recht, Klinische Farmacologie en Farmacotherapie" "Development of a cure for rare cardiac diseases is a risky, costly and time-consuming process, which is hampered by insufficient insight into pathophysiological mechanisms of the diseases and lack of relevant disease models.The GEREMY consortium proposes to overcome this challenge by developing a gene therapy (GT) for inherited arrhythmogenic cardiomyopathy (ACM), by targeting the disease-causing PLN (non-desmosomes) and PKP2 (cardiac desmosomes) mutations. The GEREMY consortium will apply a unique parallel approach and investigate various promising GT approaches (oligonucleotide chemistries, gene editing and gene delivery). Also, the consortium will engineer disease models for proper assessment of therapeutic interventions and aims to provide in vitro & in vivo preclinical proof-of-concept for the GT.A significant benefit compared to current technologies is that the GT has the potential to be a curative treatment for rare cardiac diseases. Based on previous successes, GEREMY will target PLN & PKP2 as a roadmap of the technology. Restoring the primary defect in the PLN & PKP2 genes that cause the disease will lead to preserving or even restoring myocardial contractility. Through this approach, GEREMY will work towards a curative treatment of inherited ACM and likely other cardiomyopathies, which significantly reduces the healthcare burden.The project’s experts in preclinical research and cardiac genetics will deliver preclinical efficacy and safety data for the mutation correction. The partners with regulatory and clinical trial expertise (EXOM, EUF, NLHI) will prepare for immediate start of clinical trials upon project completion, and apply for orphan drug designation. EUPATI, a patient organisation and KUL ethics partner will ensure that the project is continuously aligned with patient needs and ethical perspectives. The whole consortium will contribute to communicate an disseminate the results to ensure maximum exploitation of this breakthrough technology." "Genetische therapy voor EYS- en USH2A-geassociëerde retinale dystrofie (‘GET-READY’)" "Katrien Remaut" "Vakgroep Geneesmiddelenleer" "Erfelijke netvliesaandoeningen (IRD's) zijn een groep aandoeningen met een prevalentie van ongeveer 1 op 3.000 mensen, goed voor ongeveer 200.000 patiënten binnen de Europese Unie. Vanwege de complexiteit van het visuele systeem, worden enkele honderden eiwitten uniek tot expressie gebracht in het netvlies, en IRD is geassocieerd met mutaties in meer dan 200 verschillende genen. In het afgelopen decennium hebben specifieke voordelen van het oog dit orgaan op de voorgrond van gentherapeutische ontwikkeling geplaatst, inclusief gentherapie met behulp van virale vectoren voor de overdracht van correcte cDNA-kopieën van gemuteerde genen. Recent succes in klinische onderzoeken hebben het nut van gen therapieën aangetoond bij de behandeling van IRD's en patiënten in heel Europa wachten nu op genspecifieke benaderingen voor elk genetisch subtype van IRD. Voor patiënten met mutaties in grote genen, waaronder twee genen die het vaakst zijn gemuteerd in IRD, namelijk EYS en USH2A, wordt klinische vertaling belemmerd door de beperkte laadcapaciteit van adeno-geassocieerd virus (AAV) -vectoren, de huidige voorkeursvector bij retinale gentherapie. Het doel van ons voorstel is om deze beperking op twee manieren aan te pakken. Eerst zullen we alternatieve therapeutisch middelen ontwikkelen, voor genoombewerking met behulp van state-of-the-art methoden zoals AON-gebaseerde splitsing modulatie, PRIME-editing en nieuw geïdentificeerde Cas-eiwitvarianten. Ten tweede zullen we de toedieningssystemen optimaliseren die een optimale aflevering EYS- en USH2A-coderingssequenties naar het netvlies kunnen garanderen, inclusief een inteïne-gebaseerde meervoudige AAV-benadering, nieuw geïdentificeerde adenovirale vectoren en de nieuwste versies van nanodeeltjes. Om zo dicht mogelijk bij de patiëntenpopulatie te blijven, zullen we gebruik maken van patient specifieke cellulaire modelsystemen, gevestigde cellijnen en retinale organoïden van geïnduceerde pluripotente stamcellen. Waar nodig en gerechtvaardigd zullen we in vivo ook de zebravis en het varken inzetten als twee systemen die relevant zijn voor ziektepathologie. Een nauwe band met patiënten organisaties zal zorgen voor de verspreiding van de resultaten om de bekendheid hiervan te vergroten voor patiënten met EYS- en USH2A-mutaties. Een succesvol resultaat van GET-READY zal de ontwikkeling van nieuwe behandelingen aanzienlijk bevorderen, en bijgevolg bijdragen tot het verbeteren van de levenskwaliteit van deze patiënten en de sociaaleconomische last als gevolg van progressief verlies van het gezichtsvermogen verminderen." "Gen therapeutische interventie tijdens ex vivo long perfusie als een platform voor het moduleren van menselijke longziekte" "Marianne Carlon" "Respiratoire Aandoeningen en Thoraxheelkunde (BREATHE), Moleculaire Virologie en Gentherapie" "Longtransplantatie (LTx) is de meest effectieve therapie om patiënten met een ernstige longziekte te behandelen. LTx gaat echter gepaard met een laag overlevingspercentage. Primaire greffe-dysfunctie (PGD) is een ernstige vorm van acute longschade na LTx en is een van de hoofdoorzaken van de lage overleving. Hoewel er veel vooruitgang is geboekt in het inzicht in de risico's en mechanismen van PGD, is er nog steeds geen effectieve behandeling. Ex-vivo longperfusie (EVLP) houdt de donorlongen in een fysiologische en metabole toestand en biedt een uniek platform om behandelingsinterventies aan te bieden om PGD te voorkomen. Met een CRISPR-gebaseerde genoom-editing strategie, willen we het potentieel van het uitschakelen van PGD-gerelateerde genen (bv. IL-6) tijdens EVLP bestuderen. In dit doctoraatsonderzoek zullen twee verschillende ‘delivery vehicles’ onderzocht worden om de CRISPR-Cas9 machinerie efficiënt maar tijdelijk in de cellen van de long te introduceren: adeno-geassocieerde virale (rAAV) vectoren en Virus-Like Particles (VLPs). Na in vitro optimalisatie van de delivery, door middel van reporter-gen expressie, trachten we na te onderzoeken of CRISPR-Cas9 gen knock-out (gericht tegen een PGD-gen van belang) de ernst van PGD kan verminderen, zowel in vitro als in vivo." "Gencorrectie voor mucoviscidose - de vertaalbaarheidsdrempel aanpakken" "Marianne Carlon" "Moleculaire Virologie en Gentherapie" "Dit project richt zich op nieuwe methoden voor gencorrectie en toeleveringsmethoden om een gentherapiebehandeling te ontwikkelen voor de monogenetische ziekte taaislijmziekte of muoviscidose, die zich voornamelijk manifesteert als longziekte. Doelstellingen: (1) Het gebruik van gencorrectie (met name base & prime editing) voor efficiënte correctie van CFTR (mutaties in het CFTR-gen zijn verantwoordelijk voor taaislijmziekte) in primaire menselijke organoïden en luchtwegmodellen. (2) Het ontwikkelen van veilige en efficiënte toeleveringsmiddelen (partikels) voor de gencorrectie enzymen, met als uiteindelijk doel menselijke longepitheelcellen te kunnen bereiken. (3) Het bepalen van de invloed van de (zieke) longmicro-omgeving op de aflevering van de gencorrectie componenten. Het project omvat laboratoriumwerk, waaronder het ontwerpen en kloneren van DNA-constructen, het gebruik van virale vectoren (adeno-geassocieerde virale vectoren) en virusachtige deeltjes (VLP's), het werken met primaire cellen en orgaan-op-chip-systemen, immunohistochemie, microscopie, flow cytometrie en andere biochemische analyses, evenals moleculaire biologie, waaronder bio-informatica-evaluatie voor de efficiëntie van gencorrectie en veiligheidsevaluatie op basis van sequentieanalyse (Sanger, NGS)."