Titel Promotor Affiliaties "Korte inhoud" "H2020: RIA: Protect: Het beschermen van het stijgen van het zee niveau" "Philippe Huybrechts" "University of East Anglia, Royal Netherlands Meteorological Institute, Delft University of Technology, Alfred-Wegener-Insitut für Polar- und Meeresforschung, Technical University of Denmark, Swansea University, King's College London, University of Liege, University of Bristol, University of Leeds, Université libre de Bruxelles, Utrecht University, University of Zurich, EC, Executive Agency for Small and Medium sized Enterprises, Fysische Geografie, Geografie, Wetenschappen van het Systeem Aarde" "PROTECT zal SLR-projecties verder dan de state-of-the-art duwen en heeft een langdurige wetenschappelijke en maatschappelijke impact door (i) ons begrip en modelrepresentatie van ijskapprocessen aanzienlijk te verbeteren, (ii) een stapsgewijze verandering bieden bij het modelleren van de interacties en feedback tussen atmosfeer, oceaan en ijskappen, (iii) verbetering van de robuustheid van de resulterende spiegelreflexprojecties, met een duidelijke verspreiding van onzekerheden van mondiaal naar regionaal schalen, (iv) het beoordelen van de maatschappelijke implicaties van hoogwaardige SLR's voor ijskappen gedurende decennia tot eeuwen, (v) ontwikkeling en begeleiding van de volgende generatie wetenschappers op zeeniveau." "Optimalisatie van een faagtherapie tegen bacteriële pathogenen in kool en prei" "Anneleen Volckaert" "Kenniseenheid openlucht groenteteelt, KULeuven, EIGEN VERMOGEN VH INSTITUUT VOOR LANDBOUW- EN VISSERIJONDERZOEK, Proefstation voor Groenteteelt, Inagro, provinciaal extern verzelfstandigd agentschap in privaatrechtelijke vorm" "TERUGBLIK Werkpakket 1: Optimale toepassing van fagen in de teelt van kool en prei Taak 1: Kritieke bodembesmetting voor infectie van kool door Xcc en van prei door Pspo Xcc en Pspo zijn zaadovergaande bacteriën. Daarom wordt een vaststelling in een gewas dikwijls toegewezen aan besmetting van zaden die dan op de plantenkwekerijen wordt overgezet op de jonge planten. Zaadbedrijven doen nochtans inspanningen om gezonde zaden te leveren. Maar de routes voor zaadbesmetting zijn nog niet volledig gekend en een micro-besmetting kan in de gunstige omstandigheden macroschade aanbrengen. De genetische structuur van de Xcc en Pspo stammen van de Vlaamse velden vertoont niet de variatie die je zou verwachten als de bacteriën gangbaar door  besmette zaden worden geïntroduceerd. Hieruit volgt dat in Vlaanderen bodembesmetting de belangrijkste (bron) zou zijn voor infectie. Er is aangetoond dat Xcc koolplanten langs de wortels kan infecteren. De bacterie koloniseert dan het vasculair systeem. Voor jonge bloemkoolplanten was een relatief hoge hoeveelheid bacteriën aan de wortels (drench) en wortelbeschadiging (knippen) nodig voor symptomatische infectie. Als bloemkoolplantjes cv. Giewont zonder mechanische wortelbeschadiging in een besmette grond van 104, 106 of 108 Xcc/g werden opgekweekt, dan werden na 12 weken geen symptomen van zwartnervigheid vastgesteld in de bladeren. De analyse van het vaatweefsel van een stengelsegment net boven de wortels door selectieve isolatie en TaqMan PCR toonde Xcc ook niet aan als latente infectie in de individuele koolplanten. Blijkbaar was de infectie daar niet geïnstalleerd. In wortelmonsters werd Xcc door TaqMan PCR wel sporadisch aangetoond in het object 106 Xcc/g (1/18 planten) en in het object 108 Xcc/g (7/18 planten). Dat de infectie niet in het bovengronds vasculair systeem van de koolplanten is vastgesteld heeft mogelijks te maken met de bijwijlen hoge temperatuur (tegen 40°C) in de serrecompartimenten. Provisoir kan worden aangenomen dat vasculaire infectie van Xcc in koolplanten vanuit een besmette bodem mogelijk is maar onvoorspelbaar is en traag verloopt. Omdat beschadiging van de wortels de infectie bevordert zijn op koolpercelen plaatsen waar die zich kunnen voordoen, zoals aan spuitsporen. Het is evenwel weinig waarschijnlijk dat de gebruikte niveaus van bodembesmetting op koolpercelen zouden optreden. Het is aannemelijk dat bodembesmetting in het ontstaan van infecties vooral Xcc met opspattend water op koolbladeren doet afzetten. Alternatief kan Xcc vanuit de wortels doorheen het vasculair systeem in gutatiedruppels aan de bladrand worden gebracht waarna infectie daar aanvangt. In een gelijkaardig experiment werden preiplanten cv. Harston niet in de wortels geïnfecteerd in besmette preigrond. De bacterie is geen vasculair pathogeen. Ze overleefde wel aan de preiwortels. Als bijgevolg prei in een besmette bodem wordt geplant dan moet de bacterie eerst op de bladeren worden afgezet, bv. via opspattend water, om infectie te veroorzaken. Bodembesmetting kan dus van belang zijn tijdens de opkweek van jonge planten. Experimenteel werd prei gezaaid in besmette grond met 106 en 108 Pspo/g en werd de bacterie van respectievelijk 19 en 81 van 100 kiemplanten met TaqMan PCR gedetecteerd. De bacterie had zich epifytisch op de zaailingen geïnstalleerd, net zoals die dat doet op zaailingen vanuit besmette zaden. Dit impliceert dat fagen de preibladeren reeds op het zaaibed moeten beschermen. Na uitlichten van de planten op het zaaiperceel wordt blad immers goed ingekort. Deze beschadiging versmeert de bacterie en werkt infectie in de hand. Faagbehandelingen op het zaaibed zijn bijgevolg aangewezen om het primair inoculum van Pspo klein mogelijk te houden. Aangezien besmetting van Pspo in zaadloten niet denkbeeldig is, kunnen fagen vanaf de kieming bescherming bieden.De besmetting van het plantsubstraat werd uitgevoerd met bacteriezieke kool- of preibladeren gehomogeniseerd met water in een blender. De bacterie bevond zich in virulente toestand. In de uitgevoerde simulaties werden de besmettingen onecht hoog aangemaakt zodat binnen een relatief kort tijdskader de uitwerking van de test kon worden gemeten. In gepubliceerd onderzoek is de natuurlijke besmetting op kool- en preipercelen zelden hoger dan 104 bacterie/gram grond. Het aandeel van bodembesmetting in ontstaan van bacterieziekte in kool en prei wordt sterk bepaald door de onderzoeksmethodiek (planktonische cellen of zieke plantenresten, uitkweken van de bacterie op semiselectieve voedingsmedia of detectie in PCR). Gebruik van een GFP-gelabelde Xcc en Pspo stam kan meer inzicht brengen in het aandeel van bodembesmetting in de infecties van koolplanten. Taak 2: Kwantitatieve PCR voor faag tracking Een detectietool werd ontwikkeld en uitgewerkt om de gebruikte fagen op te sporen in de bodem en in/op planten. De real-time PCRs op het SYBR Green principe werden ontworpen uit de genomische sequenties van de KIL-fagen van Pspo en de SoPhi-fagen (later hernoemd als FoX-fagen) van Xcc. De assays werden geoptimaliseerd op gevoeligheid en specificiteit. De specifieke detectie van de KIL-fagen kan worden gedaan met een 101 bp sequentie in een gen dat codeert voor een putatieve serine protease. De gevoeligheid van de assay in faagbuffer (Level Of Detection) is 5 kopijen in de PCR reactie bij een gemiddelde Ct-waarde van 36,3. De test toont een efficiëntie van 94% over 8 logs faag DNA. De vijf KIL-fagen worden gedetecteerd (100% inclusiviteit). Zowel in silico analyse als in labtesten detecteerde de assay geen andere fagen (100% exclusiviteit). Het was niet mogelijk om alle FoX-fagen in één assay te detecteren. In een bio-informatica pipeline met aangepast script werden 3 primersets uitgewerkt voor FoX1/FoX2 en 4 primersets voor FoX4 met amplicons van 100 bp tot 102 bp. De gevoeligheid van de meest geschikte assay in faagbuffer (Level Of Detection) is 85 kopijen in de PCR reactie bij gemiddelde Ct-waarde van 34. Detectie van FoX-fagen is minder gevoelig dan van KIL-fagen. De test toont een efficiëntie van 94% over 9 logs faag DNA. De FoX2 primers bleken naderhand ook de FoX3- en FoX5-fagen te detecteren.Voor toepassing van de qPCRs in plant- en grondmonsters werd verdere validatie uitgevoerd met gBlocks, synthetische DNA moleculen van de doelsequenties van de KIL en FoX fagen (304 bp). Die werden toegevoegd aan extract van respectievelijk koolwortels en preiblad. Detectie werd verkregen tot 0.05 fg gBlock in de PCR reactie, wat overeenkomt met 152 kopijen in de PCR reactie. Toepassing van de qPCR assays in wortel- of bladextract heeft een nadelig effect op de LOD. Daarom is de isolatie van DNA via een extractiekit wenselijk. Monsters van 250 mg koolwortels werden gespiked met faagoplossing FoX2 + FoX4 van 2.106 tot 2.10-1 pfu/ml. De isolatie van gDNA werd uitgevoerd met de Qiagen DNeasy Powersoil Pro kit en 5µl hiervan werd toegevoegd aan de qPCR assay voor FoX2 en FoX4. De FoX2 qPCR gaf gedegradeerde FoX-faag aan maar de FoX4 qPCR assay vertoonde een duidelijke gradiënt van Ct-waarden overeenkomstig de toegevoegde faaghoeveelheden. De qPCR testen werden verder geëxploiteerd in het onderzoek. Taak 3: Bioassays voor bodemapplicatie van fagen in de kolenteelt en voor bladapplicatie van fagen in de preiteelt Bioassays preiAangezien Pspo infecties in de loop van dit project minder relevant bleken te zijn voor de praktijk (er worden de laatste jaren weinig tot geen Pspo infecties waargenomen) en we al eerder een werkende bioassay met fagen publiceerden (Rombouts et al. Front. Microbiol. 2016, 7, 1–15), hebben we ons vooral gefocust op bioassays in kool (zie verder).In het laatste jaar hebben we een andere bioassay ontwikkeld. Jonge preiplanten (Harston) werden hiervoor bespoten met faagoplossing en 0.05% Silwet Gold als uitvloeier. Na drogen (+/- 30 min) werd een bacterieoplossing gespoten op de planten. De topjes van de planten werden 14 dagen na infectie afgeknipt om de hoeveelheid bacteriën te kwantificeren via qPCR. Bij een MOI (multiplicity of infection; de faag:bacterie verhouding) van 10 is er een stijging van het aantal Pspo-negatieve planten, een resultaat dat voorzichtig positief is.Bioassays koolOp basis van WP2 (zie verder) werden FoX2 en FoX6 geselecteerd als optimale faagcocktail tegen Xcc. Zowel FoX2 als FoX6 werden vervolgens geëvalueerd in een irrigatie-gebaseerde faagtoepassing. Hiervoor werd eerst als preliminaire test de opname van de faag door de plant getest door een concentratiegradiënt aan faagcocktail FoX2/FoX6 (106 - 107 - 108 - 109 - 1010 PFU/mL) te voeden aan bloemkoolzaden (Giewont) als phytodrip (1 ml per zaad, 5 herhalingen, 4 zaden per herhaling). De negatieve controle zaden kregen faagbuffer. Na faagtoepassing in de bodem werden de zaailingen opgegroeid op 16°C onder een 16u/8u dag/nacht regime tot het BBCH10 groeistadium (14 dagen, eerste echte blad zichtbaar). Vervolgens werden de zaailingen uit de bodem getrokken en drie maal gewassen met 10 ml faagbuffer/0,1% Tween20 en eenmaal met steriel water om de externe fagen te verwijderen. Na homogenisatie werd het plantenmateriaal geresuspendeerd in 1 ml faagbuffer, waarna het werd gecentrifugeerd (10000 g). Tenslotte werd het supernatans gefilterd (0,45 µm) en werd de faagconcentratie van FoX2 en FoX6 bepaald door titratie op respectievelijk GBBC1419 en GBBC1412. Bij een behandeling van 106 en 107 PFU fagen konden geen fagen worden gerecupereerd uit het plantenweefsel, terwijl bij de hogere concentraties van behandelingen wel fagen konden worden geisoleerd uit de zaailingen, hetgeen aantoont dat de zaailingen wel degelijk de fagen opnemen en dat ze getransporteerd worden in de plant. De concentratie in de zaailingen is dosisafhankelijk en de minimale concentratie aan faag om fagen terug te kunnen vinden in de plant is 108 PFU/ml.Omdat we nu weten dat fagen worden opgenomen in de plant na phytodropbehandeling werd een bioassay uitgevoerd om de effectiviteit van deze faagbehandeling tegen Xcc infectie na te gaan. Hiervoor werden 150 bloemkoolzaden (Clarina) bij uitzaaien behandeld met 108 of 109 PFU faagcocktail. Vervolgens werden ze gedurende 5 weken opgegroeid en wekelijks behandeld met dezelfde hoeveelheid fagen als bij zaai door aangieten. Per plant werden dan vier bladeren geïnfecteerd met Xcc (GBBC1412 of GBBC1419; 10 planten per conditie) door ze in te knippen met een schaar die werd gedompeld in bacteriesuspensie (108 CFU/ml). De planten werden bewaard on hoge luchtvochtigheid en geëvalueerd na 10 dagen op Xcc symptomen. Deze bioassay toont aan dat behandeling met 109 PFU FoX2 voldoende is om infectie met GBBC1419 (invasief door een knip in het blad) te voorkomen (significant op p-value 0.0002). FoX6 behandeling werkt niet om infectie met GBBC1412 te voorkomen. Enkel FoX2 blijkt dus efficiënt te zijn in planta onder deze omstandigheden.Omdat Xcc infecteert via het blad werd behandelingen met FoX2 verder geëvalueerd in een bladbehandeling. In een eerste set-up werden de bacterie (GBBC1419) en faag gemengd in verschillende concentraties (107 CFU/mL met 106, 107 en 108 PFU/mL, gesupplementeerd met 0.025% Silwet Gold uitvloeier) en gespoten over jonge wittekool plantjes (2 herhalingen, 3 planten per herhaling). Na toepassing van de bacterie-faagcocktail werden de planten 14 dagen geplaatst onder hoge luchtvochtigheid voor het scoren van de Xcc symptomen. Deze proef toonde aan dat een spuitbehandeling aan MOI 10 (107 CFU/ml bacterie en 108 PFU/ml FoX2) resulteert in significant minder aangetast bladoppervlak en in significant minder infecties per blad. Bladbehandelingen aan lagere MOIs zijn niet effectief. In een tweede set-up werd een meer realistische situatie nagebootst door een faagbehandeling te doen alvorens de bacteriële infectie uit te voeren (ook via bespuiting aan 107 CFU/ml met 0.025% Silwet Gold). Dit werd in twee onafhankelijke herhalingen uitgevoerd met drie planten per conditie. Dit resulteerde in een symptoomreductie van 34% and 40% na een respectievelijke behandeling met MOI 10 en 100 (p = 0,0032 en 0,0008). Bij een MOI van 100 is er ook een significantie reductie van het aantal infectiepunten per blad (p = 0,0178).  Taak 4: Zaadbehandeling Zaadbehandelingen preiDe effectiviteit van de KIL3b en KIL5 cocktail werd getest in een zaadbehandeling. Hiervoor werden preizaden (Rijkzwaan) na sterilisatie (5% hypochloriet) en droging (1u) artificieel besmet met CFBP 1770 (OD 0.1) gedurende 16u. Na drogen (3u) resulteerde dit in 108 CFU/g besmettingsgraad. Vervolgens werden de zaden geweekt in faagoplossing (109 PFU/ml) en geïncubeerd gedurende 7 dagen in drie biologische herhalingen. Dagelijks werd de bacteriële concentratie in de zaden gemeten, alsook de faagconcentratie door 1 g zaad te homogeniseren in 1 ml PBS. Bacteriën werden gekwantificeerd op selectieve Pseudomonas P agar (Difco). Uit deze test bleek dat de bacteriële concentratie in niet-faagbehandelde zaden vrij constant bleef op 108 CFU/g. Na faagbehandeling, daalde de concentratie 2 log eenheden tot ongeveer 106 CFU/g. De faagconcentratie bleef ook vrij constant rond 107 PFU/g met een stijging op dag 2, dat aantoont dat er wel degelijk infectie en amplificatie is op de zaden. De zaden werden niet verder gekiemd.Zaadbehandelingen koolDe effectiviteit van zowel FoX2 als FoX6 werd geëvalueerd op zowel artificieel als natuurlijk geïnfecteerde bloemkoolzaden (Giewont). In de eerste artificiële set-up werden de zaden eerst gesteriliseerd met 5% javel, gespoeld met steriel water en gedroogd gedurende 1u in een laminaire flow. Hierna werden de zaden geschud in bacterieoplossing (GBBC1412 of 1419) gedurende 2u en terug gedroogd, resulterende in een finale concentratie van 108 – 106 – 104 CFU/g zaad. Hierna werden zowel steriele (controle) als geïnfecteerde zaden geweekt gedurende 18u op 16°C al dan niet in 108 PFU/ml faagoplossing. De bacterie- en de faagconcentratie werden gevolgd door 0.3 g zaden te homogeniseren in 1 ml PBS (fosfaatbuffer) en uitplating op semi-selectief medium voor Xcc (briljant cresyl blue-starch medium) in 6-voud. De overige zaden werden steriel gezaaid in 1/4e Murashine en Skoog medium gesupplementeerd met 10 g/l phytagel en opgegroeid gedurende 14 dagen op 16°C en onder een 16/8 dag/nachtregime. In de tweede set-up werden natuurlijk geïnfecteerde zaden (ter beschikking gesteld door een lid van de GG) behandeld met 108 PFU/ml fagen gedurende 18u en verder op dezelfde manier behandeld als de artificieel besmette zaden. De stam die deze zaden infecteerde werd eerst gevoelig getest op infectie met FoX2 of FoX6.Er is steeds een duidelijke reductie van het aantal bacteriën na zaadbehandeling met FoX2 of FoX6. Deze reductie is het hoogste bij artificieel besmette zaden (108 CFU/zaad) met een 1,5 of een 1,7 log reductie. Een lagere bacteriële concentratie (106 of 104) leidt tot een lagere reductie. Bij natuurlijke geïnfecteerde zaden werd een 1 of een 1,2 log reductie geobserveerd na behandeling met respectievelijk FoX2 en FoX6.   Werkpakket 2: Kwaliteit van de faagcocktail optimaliseren Taak 1: Isoleren van resistente bacteriën, testen op kruisresistentie tegen verschillende fagen en virulentietesten KIL fagen tegen PspoHet voorgaande LA traject resulteerde in 6 fagen specifiek voor Pspo: KIL1-5 en een H-mutant (een host range mutant die geëvolueerd werd om extra gastheren te herkennen) KIL3b die een iets groter bereik heeft dan KIL3 (Rombouts et al. Front. Microbiol. 2016, 7, 1–15). Alle Pspo stammen in collectie zijn gevoelig aan KIL3b en/of KIL5. Samen hebben deze fagen dus een gastheerspectrum van 100%. Er werden in de loop van dit project geen natuurlijk resistente bacteriën geïsoleerd uit veldstalen. Wel werden er resistente stammen gemaakt voor de receptoranalyse (WP2 Taak 3, zie verder). Sommige resistente stammen zijn resistent tegen zowel KIL3b als KIL5, terwijl andere stammen geen kruisresistentie vertonen.    De transposon mutant in OX88_RS20865 (coderende voor een membraaneiwit) werd getest voor zijn virulentie op prei. De bladeren van volwassen preiplanten van cultivar Krypton (Nunhems) werden hiervoor beschadigd met een naald. Vervolgens werd 100 µl bacteriesuspensie (108 CFU/ml) geïnjecteerd in het blad (5 planten, 3 bladeren per plant). 10 dagen na infectie werd de lesielengte gemeten.Ook werden er in het zaadbehandelingsrexperiment 4 bacteriën opgepikt die resistent waren aan KIL3b en KIL5. Deze werden gesequeneerd en een SNP analyse werd uitgevoerd (resultaten gepubliceerd in Holtappels et al., 2020; zie leverbaarheden). Deze mutanten vertonen ook puntmutaties in genen geassocieerd met LPS biosynthese. Hoewel de virulentie niet werd getest, kunnen we een verlaagde virulentie verwachten aangezien dit in literatuur al beschreven staat voor sommige van de gevonden LPS-mutanten (bv. wbpM, zie Creuzenet et al., Mol Microbiol 2001, 41, 1295-1310).FoX fagen tegen XccBij de start van dit LA project waren er al zeven fagen beschikbaar tegen Xcc: SoPhi1-7. Na herhaalde pogingen konden SoPhi5-7 niet gerecupereerd worden uit de beschikbare faagstocks, waaruit we konden besluiten dat deze fagen niet stabiel waren. In de loop van dit project werden drie nieuwe Xcc fagen geïsoleerd. Alle fagen werden hernoemd tot FoX1-7. Op basis van hun genoomsequentie, kunnen de FoX fagen ingedeeld worden in 3 clades. De eerste groep bestaat uit FoX1, FoX2, FoX3 en FoX5. FoX4 vormt een aparte groep en FoX6 en FoX7 vormen een derde groep. De FoX1-achtige fagen vormen nieuwe faagspecies, verwant aan het Jilinvirus genus aangezien ze een vergelijkende genoomarchitectuur hebben. FoX4 vormt ook een nieuw faagspecies, van ver verwant met leden van het Sanovirus genus. FoX6 en FoX7 tenslotte zijn hetzelfde species als de reeds beschreven faag Carpasina.Tussen 2011 (start voorgaande LA traject) en 2020 werden in totaal 68 verschillende Xcc stammen geïsoleerd van een diverse collectie aan Brassica spp. Alle Xcc stammen in collectie werden getest op gevoeligheid aan de verschillende FoX fagen. Hieruit bleek dat de FoX1-achtige fagen een parallel gastheerspectrum hebben aan FoX4, FoX6 en FoX7. Er zijn dus geen stammen beschikbaar die efficiënt door beide faagtypes kunnen worden geïnfecteerd. Als we enkel de lokaal geïsoleerde stammen in beschouwing nemen, kunnen FoX2 en FoX6 gezamenlijk 80% van de collectie infecteren. Er zijn een aantal resistente stammen beschikbaar. Om een idee te hebben van hoe onze Xcc collectie er uit ziet en of deze representatief is voor een bredere collectie werden 24 stammen (gevoelig of resistent aan de fagen) geselecteerd en geanalyseerd door whole genome sequencing. Deze sequenties werden gesupplementeerd met beschikbare Xcc genoomsequenties van NCBI en vervolgens werd een core genome analyse gedaan.Een phylogenetische analyse van de data toont dat er 4 Xcc clusters zijn. Onze collectie bevat isolaten uit elk van deze clusters en is dus wel degelijk representatief. De FoX1-achtige fagen kunnen isolaten uit twee clusters infecteren, terwijl FoX4 en FoX6 isolaten uit de vier clusters kunnen infecteren. Onze collectie bevat resistente stammen uit twee clusters. Deze zijn steeds resistent tegen alle fagen.Een aantal resistente GBBC1419 stammen bekomen uit de receptoranalyse (zie verder) werden geëvalueerd op hun virulentie en vergeleken met de wildtype GBBC1419. Enkel een mutant in een epimerase/dehydratase proteïne vertoont een significant lagere virulentie. De andere mutanten vertonen ook zichtbaar een lagere virulentie, zij het niet significant. Taak 2: Isolatie van H-mutanten KIL fagen tegen PspoAangezien alle Pspo stammen uit onze collectie kunnen geïnfecteerd worden door KIL3b en/of KIL5 was er geen noodzaak om een H-mutant te evoluëren.FoX fagen tegen XccIn het begin van het project waren er enkele stammen resistent tegen de toen beschikbare fagen. In de loop van het project werd de faagcollectie aangevuld met een aantal nieuwe isolaties op resistente stammen. Maar er zijn nog steeds stammen die resistent zijn aan alle fagen. Tot nu toe konden hier geen fagen tegen worden geïsoleerd of geëvolueerd. Aangezien FoX2 en FoX6 gezamenlijk 80% van de collectie infecteren, werd verder gegaan met deze faagcocktail. Taak 3: Faag receptoranalyse m.b.v. transposon mutagenese KIL fagen tegen PspoTijdens de eerste biënnale werd de focus gelegd op de verdere moleculaire karakterisatie van de bacteriofagen uit de geselecteerde cocktail KIL3b en KIL5 om alzo een faagcocktail te hebben waarbij de kans op resistentieontwikkeling minimaal is. Een protocol gebaseerd op transposon mutagenese (details gepubliceerd in Holtappels et al. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 2930) leverde verschillende eiwitten op betrokken in biosynthese van LPS voor KIL3b, terwijl een hypothetisch membraaneiwit werd geïdentificeerd voor KIL5. LPS is dus waarschijnlijk de primaire receptor van KIL3b terwijl KIL5 mogelijks een membraaneiwit herkent als receptor. Door complementatie van het dTDP-4-dehydrorhamnose reductase (gecodeerd door dhrr) of het membraaneiwit (gecodeerd door OX88_RS20865) en adsorptietesten werden deze receptoren bevestigd. We kunnen bijgevolg besluiten dat KIL3b en KIL5 een andere receptor herkennen en dus complementair zijn in de cocktail met een lagere kans op resistentieontwikkeling.FoX fagen tegen XccDezelfde techniek werd gebruikt om de receptor van FoX2 en FoX6 te identificeren. Voor beide fagen lijkt LPS de receptor te zijn. Voor FoX2 lijkt EPS (exopolysaccharide) een mogelijks secundaire receptor aangezien een mutant van het epimerase/dehydratase eiwit ook resistentie geeft tegen FoX2. De receptoren werden bevestigd als zijnde belangrijk voor adsorptie door een adsorptietest uit te voeren met fluorescent gekleurde fagen en vervolgens via microscopie de fluorescentie te kwantificeren. Voor beide fagen lijkt de wxc gencluster belangrijk te zijn voor faaginfectie.   Vervolgens toonden we aan dat variatie in de wxc gencluster (LPS biosynthese) verantwoordelijk is voor het parallelle gastheerspectrum van de FoX-fagen. De gencluster werd hiervoor geëxtraheerd uit de genoomdata (zie hierboven) en gebruikt voor een MLST analyse. De stammen splitsen mooi uit in de FoX1-gevoelige stammen en de FoX4/6-gevoelige stammen. Voor de faagcocktail tegen Xcc zal er dus steeds een combinatie nodig zijn van twee fagen die elk van deze groepen kunnen infecteren. Taak 4: Verifiëren van transductiepotentieel Een protocol werd opgesteld om het transductiepotentieel van de verschillende fagen te testen. Hierbij werden fagen opgegroeid op een stam met een antibioticumresistentiemerker. Deze fagen werden vervolgens gebruikt om een antibioticumgevoelige stam te infecteren. De infectie werd gestopt en de bacteriën werden uitgeplaat op selectief medium. In het geval van de fagen van de twee cocktails (KIL3b – KIL5 en FoX2 – FoX6) werden geen resistente bacteriën teruggevonden. Dit gecombineerd met de sequencing data doet vermoeden dat deze fagen niet transduceren. Echter, er is geen positieve controle (een gekende transducerende faag) voor handen om de werking van het protocol te verifiëren. Taak 5: Optimalisatie faagproductie en opzuivering In eerste instantie werd de productie van de fagen geoptimaliseerd door verschillende gastheren en incubatietijden te variëren. Zo werd de productie van de verschillende fagen geoptimaliseerd tot een productie van 1010 - 1012 pfu/ml. Tijdens werkjaar 1 werd ook gefocust op de opzuivering van de KIL fagen voor Pspo met CIM anion-exchange chromatografie. De recovery voor deze fagen (hoeveel fagen die geladen worden ook effectief elueren) werd geoptimaliseerd en ligt tussen de 50 en 80% terwijl de capaciteit ligt tussen 1.109 tot 2.1011 fagen per ml kolomresin. Deze waarden zijn vergelijkbaar met wat tot nu toe in de literatuur werd beschreven. Voor de FoX2 en FoX6 fagen van Xcc werd de FPLC opzuivering ook geoptimaliseerd met een DEAE anionenuitwisselaar. De maximale bindingscapacitiet van de twee fagen bedraagt 1.49x1012 PFU en 1.12x1013 PFU per ml resin voor respectievelijk FoX2 en FoX6. Na elutie blijven 74% van de FoX2 en 47% van de FoX6 partikels infectieus. Deze opzuiveringen werden gebruikt om genoeg fagen te produceren voor alle bioassays en veldproeven. Taak 6: Verifiëren van de faagstabiliteit en de invloed van additieven hierop De stabiliteit van de fagen werd getest in verschillende pH en temperatuur condities. Zo werd een pH range van 3 tot 11 en een temperatuur range van 4°C tot 37°C getest. Hieruit is gebleken dat de fagen stabiel zijn in een range van pH 4 tot 10 en op alle geteste temperaturen voor een periode van twee weken. Verder werd de stabiliteit van de fagen getest in verschillende bladuitvloeiers: Silwet Gold veroorzaakt een kleine reductie in de concentratie van faag, Trend heeft een duidelijke negatieve invloed heeft op de faagstabiliteit, S70 en R11 hebben haast geen invloed. De fagen zijn stabiel genoeg om zo gebruikt te worden in de bioassays en veldproeven.   Werkpakket 3: Monitoring van bacterie- en faagpopulatie Taak 1: Bodembesmetting in kaart brengen In dit werkpakket wordt de bacterie-en faagpopulatie in Vlaanderen in kaart gebracht door monitoring van besmette kool- en prei-percelen. In de eerste biënnale werden minder stalen van besmet plantenmateriaal en besmette bodem genomen dan voorzien in het projectvoorstel. Dit was te wijten aan de droge zomers. Een trend die zich in de daaropvolgende jaren heeft voortgezet, met slechts enkele meldingen van aantasting, welke na analyse niet allemaal Pspo of Xcc bleken te zijn. Tijdens de staalnames werd wel vastgesteld dat Xcc enkel aan of in de wortels van zieke koolplanten konden worden aangetoond en niet in de grond als dusdanig. Daarnaast bleek dat de detectie van Xcc in de grondstalen op semi-selectief medium een lage gevoeligheid vertoonde (ongeveer 106 Xcc/gram). Taak 2: Toetsen faagcocktail aan nieuwe Xcc en Pspo isolaten Een belangrijke taak in dit werkpakket is het toetsen van nieuwe isolaten van Xcc en Pspo aan deze verkregen in het IWT project 100881. Zo kan nagegaan worden of de bacteriepopulatie verandert met de tijd. Nieuwe introducties zijn mogelijk omdat de zaadteelt op verschillende geografische locaties in de wereld plaatsvindt. Er werden meerdere nieuwe isolaten van Xcc en Pspo verkregen uit diagnostische kool- en preimonsters die werden aangeleverd door de praktijkcentra in het project. In de DNA barcode gyrB werden voor Xcc genetische verschillen aangetoond. In de DNA barcode rpoD voor Pspo werden geen genetische verschillen aangetoond. Eveneens werd getest of de bij de projectstart beschikbare fagen de nieuwe bacterie-isolaten konden infecteren. Hieruit is gebleken dat tien van de dertien nieuwe isolaten konden gelyseerd worden door de toenmalige Xcc fagen in collectie. Dit onderstreept het belang om continue faagscreenings uit te voeren zodat de faagcocktail up to date blijft. De faagcocktail werd verder uitgebreid en gekarakteriseerd. Taak 3: Screening faagpopulatie Tenslotte gebeurde in dit WP ook een screening van de faagpopulatie. Indien mogelijk werd bij elk plantenstaal aangetast door bacterieziekte ook een bodemstaal geanalyseerd op aanwezigheid van fagen. Er werden vier nieuwe FoX fagen geïsoleerd die effectief blijken te zijn tegen enkele resistente stammen (GBBC 3217 – GBBC 3236 – GBBC 3228). Deze fagen werden toegevoegd aan de bestaande faagcocktail.   Werkpakket 4: Implementatie & disseminatie Het doel van dit werkpakket was enerzijds een brede bewustmaking over bacteriofagen als ecologisch verantwoorde bestrijder en anderzijds de instructie over praktijktoepassing. Gedurende de 1ste biënnale werden al stalen genomen bij groentetelers die kampen met bacterieziekte ter monitoring van de bacterie- en faagpopulatie en ter uitbreiding van de faagcocktail. Aan deze telers werd bijgevolg ook advies gegeven over preventieve en hygiënische maatregelen. Dit werd verdergezet tijdens de tweede biënnale, hoewel het aantal meldingen van aantasting zeer laag is gebleven. Door de lage ziektedruk kon de mijlpaal van 450 adviezen helaas niet bereikt worden.In de laatste biënnale werd sterk ingezet op demonstratieproeven op de praktijkcentra, dit zowel in prei als kolen. Door de droge zomers was het moeilijk om, ondanks kunstmatige infectie, aantasting te verkrijgen in de preiproeven. Hieruit konden daarom geen resultaten bekomen worden. In 2017 hebben we wel twee kleine proeven kunnen aanleggen op een praktijkveld met natuurlijke infectie. Daar kon reeds positief effect vastgesteld worden van de toepassing van de faagcocktail (KIL3b + KIL5), in combinatie met Silwet Gold, op de aantasting. De veldproeven in kolen waren meer succesvol. Daarvoor werd gewerkt met een kunstmatige infectie, door verneveling van een bacteriesuspensie (106 cfu/ml) over het gewas. In 2018 werd voor het eerst ook ingezet op preventieve toepassingsmethoden, welke veelbelovend bleken. De daaropvolgende jaren werden deze dan ook aangelegd in de veldproeven. In 2019 werden enkel in Sint-Katelijne-Waver goede resultaten bekomen, waar opnieuw een preventieve methode, daar fytodrip met faagcocktail (108 pfu/ml), werkzaam bleek. Tijdens het laatste projectjaar werd een combinatie van fytodrip, plantbakbehandeling en aangieten met de faagcocktail (FoX2 + FoX6) (108 pfu/ml) (wekelijks of driewekelijks) uitgetest, naast een gewasbespuiting van de faagcocktail met CaCl2. Hoewel aangieten uit eerder onderzoek (met jonge plantjes) potentieel leek te hebben, waren het de gewasbespuitingen die voor significante reducties konden zorgen, zowel op het PCG als PSKW. Waarschijnlijk had de invloed van de grootte van de planten en de weersomstandigheden een effect negatief effect op de aangietmethode. Positieve effecten van het aangieten werden wel waargenomen bij Inagro en PSKW. Daarnaast werd dan weer verwacht dat de toevoeging van CaCl2 een verbeterde faagadsorptie op de bacteriën verzorgd, wat in de resultaten zichtbaar was. In de loop van het project verschenen verschillende artikels (o.a. in Landbouwleven, Proeftuinnieuws, etc.) en werd informatie van het project naar de academische wereld verspreid via presentaties op symposia. Zo werd het project o.a. voorgesteld op het Viruses of Microbes congres aan de Universiteit van Wroclaw (Polen), de Evergreen Phage meeting aan de Evergreen State College (Olympia, WA, USA); de Oxford phage meeting (Oxford, UK), het Biocontrol 2019 congres (Vitterbo, Italië), het symposium on Crop Protection aan de Ugent, aan de KU Leuven tijdens de 1st Plant-Microbe Interaction day, VIROPLANT meeting en A2H Symposium. Op 5 september 2018 werden ruim 200 bezoekers van het Internationaal Koolcongres rondgeleid op het koolplatform van Inagro waar ze een toelichting kregen rond het bacteriofaag onderzoek. Via rondleidingen op de verschillende praktijkcentra werden ook al heel wat uit de fytowereld en studenten geïnformeerd over het project en de problematiek in kolen en prei.Op Plattelandspret (tvoost) werd een korte reportage gemaakt over het project, waarbij verschillende aspecten van het onderzoek werd aangehaald (veldproeven, bioassays, labo-onderzoek). Aflevering 22, 2/11/2019: https://www.tvoost.be/programmas/plattelandspret-plattelandspret-afl-22-2019-87460 Er werden vier artikels in vaktijdschriften gepubliceerd:-          Preventieve faagbehandeling loont in de strijd tegen bacterieziekten (Proeftuinnieuws 4, 22/02/2019)-          Virussen op het veld zijn geen science-fiction (KU Leuven, Departement Biosystemen, 27/02/2020)-          Virussen kunnen gewassen beschermen (Boer&Tuinder, 12/03/2020)-          Bacterieziekten onderdrukken met fagen weer een stap dichterbij (Proeftuinnieuws 19, 6/11/2020)Volgende wetenschappelijke artikels werden reeds gepubliceerd. Het artikel over Xcc is klaar om ingediend te worden:-          Holtappels, D., Lavigne, R., Huys, I. en Wagemans, J. Protection of phage applications in crop production: a patent landscape. 2019. Viruses, 11, 277; doi: 10.3390/v11030277-          Holtappels, D., Kerremans, A., Busschots, Y., Van Vaerenbergh, J., Maes, M., Lavigne, R. en Wagemans, J. Preparing for the KIL: receptor analysis of Pseudomonas syringae pv. porri phages and their impact on bacterial virulence. 2020. International Journal of Molecular Sciences, 21, 2930; doi: 10.3390/ijms21082930-          Akremi, I., Holtappels, D., Brabra, W., Jlidi, M., Hadj Ibrahim, A., Ben Ali, M., Fortuna, K., Ahmed, M., Van Meerbeek, B., Rhouma, A., Lavigne, R., Ben Ali, M. en Wagemans, J. First report of filamentous phages isolated from Tunisian orchards to control Erwinia amylovora. 2020. Microorganisms, 8, 1762; doi: 10.3390/microorganisms8111762-          Holtappels, D., Fortuna, K., Lavigne, R. en Wagemans, J. The future of phage biocontrol in integrated plant protection for sustainable crop production. 2021. Current opinion in Biotechnology, 68: 60-71.-          Holtappels, D., Fortuna, K., Moons, L., Broeckaert, N., Bäcker, L., Vennemand, S., Rombouts, S., Lippens, L., Baeyen, S., Pollet, S., Noben, J.P., Oechslin, F., Vallino, M., Aertsen, A., Maes, M., Van Vaerenbergh, J., Lavigne, R. en Wagemans, J. Development of an integrated pest management strategy to control Xanthomonas campestris pv. campestris based on bacteriophages. Ready for submission.  Werkpakket 5: Wetgeving & intellectuele bescherming Taak 1: Europese erkenningsprocedure voor bacteriofagen verduidelijken Om faagtherapie op een veilige manier toe te passen, is een wettelijk kader nodig. Regelgeving is hierbij een grote uitdaging. Het eerste doel van dit werkpakket was de erkenningsprocedure verduidelijken. In de Europese commissie zijn nog geen faagproducten op de markt zijn, m.u.v. een Hongaars product ‘Erwiphage Plus’ tegen Erwinia amylovora infecties bij appel en peer dat enkel lokaal toegelaten is tijdens een bepaalde bloeiperiode (dient elk jaar terug goedgekeurd te worden). Dit valt dan onder een noodprocedure waarbij een lidstaat van de EU zelf een tijdelijke authorisatie kan goedkeuren.Na overleg met GAB (een Europees bedrijf die registratie van plant protection products begeleid) werd duidelijk dat faaggebaseerde (bio)pesticides momenteel wel degelijk onder dezelfde wetgeving vallen als andere plant protection products (PPPs) en dus ook hieraan moeten voldoen (de PPP regulation (EC) 1107/2009). Dit wil zeggen dat net zoals voor chemische pesticiden eerst de actieve bestanddelen moeten worden goedgekeurd door de Europese Commissie alvorens een finaal PPP kan worden geauthoriseerd in de verschillende lidstaten. De Europese Commissie wordt voor de goedkeuring van actieve stoffen geinformeerd door de verschillende lidstaten en door EFSA (European Food Safety Authority). Om een actieve stof te laten goedkeuren moet de veiligheid (voor mens, dier en omgeving) ervan aangetoond worden. Eens de actieve stof is goedgekeurd, dan geldt dit voor 10-15 jaren. Het dossier dat moet worden ingediend volgt wetgeving (EU) 283/2013. Het ingevulde dossier wordt doorgestuurd naar een lidstaat (‘de Rapporteur Member State/RMS’) die het dossier ontvankelijk verklaart en een voorlopig rapport voorbereid voor EFSA die vervolgens een peer review uitvoert en een conclusie formuleert voor de ‘Standing Committee for Food Chain and Animal Health’ van de Europese Commissie. Dergelijk proces duurt minstens ongeveer 3,5 jaar. In de Europese Unie zijn er momenteel 7 virus-gebaseerde actieve bestanddelen al goedgekeurd (voornamelijk baculovirussen en geattenueerde plantvirussen.Enkele andere bestanddelen zijn nog in aanvraag. Een belangrijke opmerking bij fagen als actieve bestanddelen is dat deze kunnen vallen onder de ‘low risk substances’ net zoals andere biologicals. De voordelen zijn dat een lagere hoeveelheid efficacy trials nodig zijn, er een ‘fast-track’ authorisatie procedure mogelijk is, en dat deze bestanddelen ineens zijn goedgekeurd voor 15 jaar ipv 10 jaar. Ook is er een langere protectie op de veiligheidsstudies (13 jaar ipv 10 jaar), zodat je producten langer IP-gewijs beschermd zijn van reproductie door een concurrent.  Eens elk actief bestanddeel is goedgekeurd, dan kan het PPP aanvraagdossier worden opgesteld volgens wet (EU) 284/2012. In dit dossier wordt niet meer geoordeeld over de veiligheid, maar het gebruik (welke gewassen, hoeveelheid van applicatie, …) dient verduidelijkt te worden. Productregistratie gebeurd in zones van de EU (Noord, Centraal en Zuid), waarbij terug 1 lidstaat per zone wordt gekozen om het dossier in te dienen. Enkele specifieke aandachtspunten voor faagcocktails als PPP: fagen hebben een nauw gastheerspectrum, een faagcocktail is daarom absoluut nodig. Die faagcocktail is één van de pijnpunten om faagproducten als PPP te laten erkennen. Tijdens de 1ste GG kwam de vraag naar identiteit: ‘Hoe sterk lijken fagen op elkaar?’. Taxonomie van fagen is de verantwoordelijkheid van het ‘Bacterial and Archaeal Viruses Subcommittee’ (onderdeel van het ‘International Committee on the Taxonomy of Viruses’). Momenteel wordt een faagspecies gedefinieerd als zijnde identiek aan een ander virus als deze fagen op DNA-niveau minstens 95% gelijkenis vertonen (Adriaenssens en Brister, 2017). Deze regel zal enorm belangrijk zijn voor de registratie van een faagspecies als actieve stof in een biopesticide. Fagen die minder dan 5% verschillend zijn op basis van hun genoom, maar eventueel wel voldoende verschillend zijn om een ander gastheerspectrum te hebben (dit kan bijvoorbeeld enkel door enkele puntmutaties in hun staartvezelgenen), zullen immers als 1 actieve stof dienen te worden geregistreerd. Ook als de fagen in het product door de jaren heen lichtjes evolueren door natuurlijke evolutie op hun gastheer, valt deze faag nog steeds onder hetzelfde registratiedossier zolang er minder dan 5 nucleotiden op 100 nucleotiden verschil is met het originele product.We ondervinden duidelijk dat faagtherapie in beweging is in Europa, in diverse sectoren. Dit wordt dan ook verder opgevolgd binnen andere faagonderzoeksprojecten (H2020 VIROPLANT, Era-Net ANIHWA, JPI-AMR AntiBio-Lab, samenwerking met brandwondencentrum, etc.). Taak 2: Mogelijkheden voor intellectuele bescherming verduidelijken Het tweede doel van dit werkpakket was de patenteerbaarheid van faag-gebaseerde producten in de landbouw verduidelijken. KULeuven heeft hierover een artikel gepubliceerd om dit te doen. De belangrijkste punten die bevonden:-          49 patentfamilies rond fagen voor gewasbescherming werden geïdentificeerd in patentdatabanken, met een stijgend aantal patenten de laatste jaren (laatste update op 17/2/2019) -          Deze stijging loopt samen met het stijgende aantal wetenschappelijke publicaties -          De meeste patenten worden ingediend door non-profit organisaties uit Azië -          Goedgekeurde patenten lijken eerder brede claims te hebben (b.v. ze claimen fagen in het algemeen voor een bepaalde toepassing ipv een specifieke faag) en gaan meestal over de applicatiemethode Alle bevindingen kunnen uitgebreid nagelezen worden in Holtappels et al. Viruses 2019, 11, 277. Naast de mogelijkheid die er wel degelijk is om een faagcocktail of het gebruik ervan te patenteren, is de procedure zoals besproken onder taak 1 ook een bescherming voor het bedrijf dat een faagcocktail wil commercialiseren. De verschillende studies die gebeuren voor een actieve stof dossier zijn immers ook beschermd voor de aanvrager gedurende 10 jaren (of 13 jaar voor biologicals). Hierdoor kan een concurrent enkel een product met de goedgekeurde fagen op de markt brengen als deze een licentie betaald aan de aanvrager van het actieve stof dossier. Dit biedt dus een extra bescherming." "Geïntegreerde beheersing van de preimineervlieg Phytomyza gymnostoma Loew in prei" "Nathalie Cap" "Kenniseenheid openlucht groenteteelt, EIGEN VERMOGEN VH INSTITUUT VOOR LANDBOUW- EN VISSERIJONDERZOEK, Proefstation voor Groenteteelt, Inagro, provinciaal extern verzelfstandigd agentschap in privaatrechtelijke vorm" "De preimineervlieg of  Phytomyza gymnostoma zorgt al enkele jaren voor aanzienlijke schade in prei, voornamelijk in het Antwerpse en het oostelijke deel van Oost-Vlaanderen. Maar de schade breidt ook uit naar West-Vlaanderen. Ook in biologische prei richt deze plaag veel schade aan. Door het recente karakter van deze plaag –de preimineervlieg werd op praktijkpercelen voor het eerst vastgesteld in 2012– was er geen adequate beheersingsstrategie voorhanden.Larven van de preimineervlieg mineren in de schacht van de prei en veroorzaken vraatgangen die de prei onverkoopbaar maken. De schade wordt pas vastgesteld bij de oogst tijdens het schonen van de prei. Omdat de door preimineervlieg veroorzaakte schade pas in de oogstperiode duidelijk wordt, is er nood aan een waarschuwingssysteem dat telers in staat moet stellen om op het gepaste moment maatregelen te nemen.De hoofddoelstelling van het project was het opstellen van een praktisch en betrouwbaar waarschuwingsmodel, gebaseerd op een daggradenmodel. Naast het daggradenmodel werd tijdens het project gezocht worden naar een goede monitoringsmethodiek voor de opvolging van de vluchten van de preimineervlieg. Hiervoor is een correcte identificatie van de preimineervlieg belangrijk. In het project werd ook het voorkomen van natuurlijke vijanden bestudeerd zodat deze kennis kon geïntegreerd worden in het waarschuwingssysteem. Tevens werden verschillende cultuurtechnische teeltmethoden uitgetest en werd de efficiëntie van diverse insecticiden met de meest efficiënte toepassingsmethode bepaald worden.Werkpakket 1 Morfologische en moleculaire herkenning van mineervliegenBinnen het eerste werkpakket stond een correcte en gebruiksvriendelijke identificatie van preimineervlieg (Phytomyza gymnostoma) voorop. Daarnaast werd beoogt de voornaamste mineervliegen te inventariseren. Daarvoor verzamelden PSKW, PCG en Inagro tijdens de monitoringcampagne rond de preimineervlieg in 2016-2017, mineervliegen. De vangsten werden ter identificatie naar het ILVO gestuurd. Meer dan 2000 vangplaten werden onderzocht onder de stereomicroscoop en alle mineervliegen werden morfologisch en moleculair geïdentificeerd. P. gymnostoma werd gedetecteerd in 16 biologische of conventionele preivelden in Vlaanderen. Naast de preimineervlieg, Phytomyza gymnostoma, vinden we op de kleefplaten heel veel lookalikes van de preimineervlieg waaronder een  aantal andere Phytomyza spp. en Liriomyza spp die een heel aantal morfologische kenmerken gemeenschappelijk hebben. De verschillende mineervliegsoorten die op de plakvallen gedetecteerd werden (taak 1.1) zijn: P. lateralis, P. cichorii, P. syngenesiae, P. rufipes, P. horticola, P. nigra, P. plantaginis, P. ranunculi, P. scrophulariae, P. spondylii, Copromyza equine, Scaptomyza pallida, Liriomyza bryoniae en L. huidobrensis). Een technische fiche voor identificatie van de preimineervlieg werd opgesteld door ILVO. De morfologische herkenning (taak 1.2) van preimineervlieg is gebaseerd op enkele basiskenmerken:  donkere poten met gele knieën, bleke halters, een geel hoofd, gele onder- en zijkanten van het abdomen, gele naden tussen de tergieten en de drie bovenste aders in de vleugels zijn donkerder. Na een morfologische selectie op basis van deze kenmerken zijn er nog veel verwante soorten waardoor een strengere morfologische selectie nodig is. Deze kan uitgevoerd worden op basis van volgende kenmerken:Thoracale beharing: -> P. gymnostoma is heel sterk behaard op de thorax, veel voorkomende lookallike P. horticola is veel minder sterk behaard. Veel lookalikes hebben echter wel een sterke beharing.Vleugels:1)      Dwarsaders: 1 dwarsader versus 2 bij P. cichorii à bij veel andere lookalikes is er ook 1 dwarsader en dit kenmerk is niet altijd goed te zien (vleugels geplooid)2)      Afstand: de afstand tussen ader 1-2 is 4 maal groter dan afstand tussen ader 2-3 à bij de meeste lookalikes is de afstand tussen ader 1-2 korter3)      Divergente/parallelle 3e en 4e vleugelader monden parallel uit aan de top van de vleugel. Bij P. chicorii divergeren deze 2 aders à met dit kenmerk kan je heel wat verwante soorten uitsluiten (niet enkel P. cichorii)Morfologische herkenning onder de stereomicroscoop is door het grote aantal lookalikes moeilijk, vaak is er een moleculaire bevestiging nodig. Zeker voor beschadigde individuen of andere stadia zoals bijv. larven. Om een correcte en snelle identificatie van P. gymnostoma in het veld te doen werd een LAMP-methode (Loop Mediated Isothermal Amplification) ontwikkeld (taak 1.3). De LAMP-methode is een gevoelige, specifieke en snelle moleculaire methode om on site toe te passen. Er worden 6 primers gebruikt wat een exact resultaat oplevert. Om deze methode te ontwikkelen, werd DNA geëxtraheerd uit de individuen van verschillende soorten die tijdens de monitoringscampagne werden verzameld. Opgestuurde individuen van P. gymnostoma populaties afkomstig uit Frankrijk en Duitsland werden ook meegenomen in de test. De sequenties van de gezuiverde PCR-producten die verkregen werden voor elke soort werden bewerkt en geanalyseerd met behulp van BioEdit en werden vergeleken met sequenties in GenBank (BlastN-optie, www.ncbi.nlm.nih.gov/). De uitlijning en vergelijking van de sequenties die verkregen werden voor individuen van P. gymnostoma vertoonden 95-97% overeenkomst met de enige P. gymnostoma-sequentie die aanwezig is in GenBank (species uit USA). Het verschil van 3-5% kan worden toegeschreven aan de waardplant en de geografische locatie van de geteste individuen. De genetische verschillen tussen verschillende soorten die werden gedetecteerd tijdens de bemonsteringsperiode werden bepaald om de LAMP-primers te ontwerpen. Via deze LAMP methode kunnen de verschillende ontwikkelingsstadia van P. gymnostoma opgepikt worden (ei, larve, pop, adult). We onderzochten ook of voedingsstippen van P. gymnostoma met de LAMP-methode kunnen opgepikt worden. Analyse van bieslookblaadjes met voedingsstippen van P. gymnostoma waarin eitjes aanwezig zijn geeft in 100 % van de gevallen positieve resultaten. Indien er geen eitjes aanwezig zijn in de voedingsstippen verkrijgen we met de LAMP methode een positief resultaat in 69 % van de gevallen. Het is onduidelijk welk genetisch materiaal van de vrouwelijke preimineervlieg in de voedingsstippen achterblijft en voor de positieve DNA-detectie zorgt. Voor de LAMP methode toe te passen on site gebruiken we de draagbare en gebruiksvriendelijke Genie III (LAMP incubatie en visualisatie machine; OptiGene ). Daarnaast onderzochten we ook of het mogelijk is om een visualisatie van de amplificatie van het doel DNA te zien op het veld/ on site mbv een kleurstof. Ook met deze methode wordt P. gymnostoma correct opgepikt. Als het doel-DNA aanwezig is wordt een geel-groene kleur waargenomen, zonder het doel-DNA is de kleur donkergroen (d.m.v. uv-licht kan nog een duidelijker onderscheid gemaakt worden).De mijlpalen binnen werkpakket 1 (‘Herkenning van de preimineervlieg op kleefplaten en in het gewas’ en ‘Detectie van niet morfologisch te identificeren stadia/individuen van de preimineervlieg in het veld via een LAMP procedure’) werden bereikt. Werkpakket 2 Ontwikkeling van een efficiënt en praktisch monitoringsysteem voor de preimineervliegBinnen dit werkpakket werd op zoek gegaan naar de meest efficiënte monitoringsmethode voor het detecteren van P. gymnostoma in het veld (taak 2.1). Hiervoor werden op praktijkvelden in West-Vlaanderen (Inagro), Oost-Vlaanderen (PCG) en in Antwerpen (PSKW) verschillende methoden uitgetest (o.a. voedingsstippen waarnemen op prei, voedingsstippen waarnemen op bieslook, gele watervangbakken, gele plakvallen). Het ophangen van gele plakvallen bleek na 2 jaar monitoren de meest efficiënte en praktische monitoringsmethode. Op deze plakvallen vonden we veel meer preimineervliegen terug in vergelijking met de gele watervangbakken.De correlatie tussen het aantal vliegen dat waargenomen wordt op de gele plakvallen is echter vaak niet gecorreleerd met de schade in het veld. In het voorjaar van 2018 vonden we vrij hoge aantallen preimineervlieg terug op de plakvallen, maar in het najaar waren de vangsten klein. Desondanks namen we op sommige velden schade waar op 5 tot 20% van de planten. Ook in het voorjaar van 2019 waren de vangsten op de gele plakvallen laag, maar was er toch een behoorlijke aantasting (26% van de planten) in een proef op het proefstation in Sint-Katelijne-Waver. In de zoektocht om de monitoringsmethode te verbeteren werd op ILVO de aantrekking naar kleur onderzocht. Hiervoor werden cilinders in verschillende kleuren gemaakt. In elk van deze cilinders werd een klein bieslookplantje gezet en vervolgens werden de cilinders in een kooi geplaatst waarin 120 volwassen vliegen werden losgelaten. Na 48 uur werden de voedingsstippepn geteld. Het hoogste aantal prikken (significant verschillend) werd gevonden op de planten in de lichtgroene cilinders, gevolgd door die in de gele en donkergroene. Ook de universiteit van Pennsylvania had weinig succes met gele of blauwe kleefplaten met vangsten van 1 tot 5 vliegen per 2 weken. ‘Sweep Netting’ bleek effectiever, vooral wanneer dit gebeurde bij koelere temperaturen of vroeg in de ochtend. In 2018 werd getracht de monitoring te finetunen en werden opnieuw verschillende monitoringsmethoden (gele plakvallen, lichtgroente plakvallen, sweep netting en monitoring van voedingstippen op bieslook). De eerste 2 jaar van het project was er nog onzekerheid over de detectie op basis van voedingsstippen. Vooraleer de vrouwelijke volwassen vliegjes eitjes kunnen afleggen, voeden ze zich door met hun legboor in de waardplant te prikken en vervolgens plantensap op te zuigen. Hierdoor ontstaan typische ‘voedingstippen’ die altijd in een lijntje op de bladeren te zien zijn. Bepaalde andere mineervliegen kunnen ook op Allium soorten voedingsstippen maken. Om na te gaan of we visueel onderscheid konden maken tussen de voedingstippen van preimineervlieg en andere mineervliegsoorten werden adulten van Liriomyza bryoniae, L. huidobrensis en L. trifolii in aparte kooien met bieslookplanten losgelaten. L. huidobrensis en L. trifolii maakten ronde voedingsstippen op de bladeren, maar deze stippen waren verspreid over het blad en niet op de bladtippen. P. gymnostoma begint zich meestal te voeden vanaf de toppen van het blad en maakt voedingsstippen in een kenmerkend lineair patroon en verplaatst zich dan naar andere delen van het blad, op basis van dit kenmerkend patroon kunnen we voedingsstippen van preimineervlieg onderscheiden van de voedingstippen van andere mineervliegsoorten. L. bryoniae en P. cichorii voeden zich niet aan bieslookplanten. De voedingsstippen op grotere prei zijn niet altijd makkelijk om waar te nemen. Naast prei zijn ook andere plantensoorten uit de Alliumfamilie geschikte voedingsbronnen voor de preimineervlieg. Bieslook is een geschikte indicatorplant omdat deze schadesymptomen op de bladeren vaak duidelijker zijn dan op prei. Volgens de literatuur over de moleculaire fylogenie van Phytomyza-soorten is P. gymnostoma de enige soort van dit geslacht die zich voedt aan Allium planten. Daarom kunnen we vertrouwen op de voedingsstippen op de bieslookplanten als indicator voor de aanwezigheid van de P. gymnostoma in het veld. De olfactorische (geur)respons en voedselvoorkeur van de preimineervlieg werden bestudeerd aan het ILVO (taak 2.2 attractie tot waardplanten), door volwassen vliegen bloot te stellen aan verschillende gecultiveerde Allium-soorten en aan een wilde soort. Bieslook bleek de meest gunstige gastheer, gevolgd door sjalot, prei, ui, knoflook, lente-ui en daslook. Een gelijkaardig resultaat bleek uit een latere proef met jonge en oude planten. Daaruit bleek dat ze jonge planten boven oude verkiezen. In de feeding preference test met verschillende soorten en cultivars, bleek ui (Stutgarter) nog meer dan bieslook te worden verkozen. Ui (Sturon) en wilde knoflook zijn het minst populair. In deze laatste proef werd ook de reproductie bekeken. Bij de soorten met de meeste voedingstippen werden ook de hoogste aantallen ontwikkelde adulten gevonden. De meeste adulten werden gevonden op bieslook en ui (Stutgarter), gevolgd door prei, en vervolgens sjalotten en look. Op ui (Sturon) en wilde knoflook werden de laagste aantallen adulten gevonden. Uit deze testen kunnen we besluiten dat bieslook een goede indicator plant is voor preimineervlieg. We onderzochten ook of bepaalde preirassen aantrekkelijker zijn voor preimineervlieg dan andere. Drie groepen van rassen werden onderzocht: zomerprei, herfstprei en winterprei. Het aantal voedingsstippen dat werd waargenomen op de verschillende rassen was niet significant verschillend. Ook de voortplanting (het aantal adulten dat werd waargenomen) was niet verschillend tussen de rassen.De tweede mijlpaal (‘Monitoringstechniek voor preimineervlieg’) werd bereikt. De monitoring zal verder gezet worden met behulp van gele plakvallen en bieslook als indicatorplanten en de opgedane kennis wordt opgenomen in het huidige W&W systeem in prei. Werkpakket 3 Biologie en fenologie van de preimineervliegBinnen dit project werd de levenscyclus en fenologie van P. gymnostoma bestudeerd. Een eerste opdracht binnen dit werkpakket was het opstarten van een kweek van P. gymnostma vliegen (taak 3.1). De kweek van de preimineervlieg vormde een struikelblok in de beginfase van het project. Na een half jaar werd de kweek van de preimineervlieg geoptimaliseerd, en verliep van dan af vlot. P. gymnostoma-volwassenen werden op prei- of bieslookplanten gekweekt in gaaskooien in een klimaatkamer bij 15°C, 68% relatieve vochtigheid en een fotoperiode van 16u:8u (L:D).  De uitgebreide kweekpopulatie maakte het mogelijk meerdere proeven simultaan op te starten, wat onontbeerlijk is gezien de lange generatietijd van de plaag en de bijgevolg uitgebreide looptijd van de proeven.Om de levenscyclus (taak 3.2) te bestuderen, werden preiplanten blootgesteld aan volwassen vliegen uit de kweek, en dit bij vijf constante temperaturen (10, 15, 20, 25 en 30°C). De ontwikkelingsduur van de verschillende ontwikkelingsstadia (ei, de larvale fase en de pop) werd bepaald om zo het daggradenmodel te kunnen opstellen. Op basis van de verkregen gegevens werden de warmtebehoefte (1255 DD) en de onderste temperatuurdrempel (5 °C) van deze soort berekend en werd een theoretisch daggradenmodel (Mijlpaal 3.1) opgesteld. De ontwikkelingsduur van ei en larven van P. gymnostoma nam af met toenemende temperatuur. De ontwikkeling van de pop werd vertraagd bij 10 en 25°C. De gemiddelde ontwikkelingsduur van P. gymnostoma bedroeg bij 10 en 25°C achtereenvolgens 156 en 135 dagen. De benodigde tijd voor het voltooien van de levenscyclus was 112,5 dagen bij 15°C (tabel 1). Naast de ontwikkeling, werd ook de reproductie van de preimineervlieg opgevolgd. De hoogste reproductiesnelheid werd waargenomen bij 15°C. Uitgezonderd bij 30°C, waarbij geen enkele pop ontwikkelde tot een vlieg, voltooide P. gymnostoma haar levenscyclus bij alle geteste temperaturen . Op basis van de thermische eisen van P. gymnostoma voor de ontwikkeling en de jaartemperatuur van België kunnen maximaal twee generaties per jaar worden voltooid. Dit is in lijn met de resultaten van het monitoringsonderzoek waar P. gymnostoma twee generaties ontwikkelt in prei: de eerste in de vroege of late lente en de tweede in oktober/november.Om een duurzame beheersingsstrategie voor P. gymnostoma te kunnen ontwikkelen, is een goede kennis nodig van het overwinteringspotentieel (taak 3.3) en de aestivatie (taal 3.4) van de poppen van dit insect in plantenresten en in de bodem. Voor het onderzoek naar overwintering (taak 3.3) werden twee belangrijke indices bepaald, waaronder de laagste letale temperatuur (LTe50) (de temperatuur waarbij de helft van de populatie sterft) en de laagste letale tijd (LTi50) (tijd na dewelke de helft van de populatie sterft bij een bepaalde ‘lage’ temperatuur). Om de lage letale temperatuur (LTe50) te bepalen werden poppen van P. gymnostoma blootgesteld gedurende 1 minuut aan lage temperaturen (-5 tot -20 °C). De poppen werden vervolgens op 15 °C gehouden en het aantal ontloken volwassenen werd geregistreerd. De LTe50 voor poppen lag rond -15 °C (Figuur 1). In een ander experiment werden poppen van P. gymnostoma blootgesteld aan verschillende temperaturen (-10, -5, 0, 5 en 10°C) gedurende 0, 1, 2, 4, 8, 16 en 32 dagen. Vervolgens werden ze overgebracht naar 15 °C om de lage letale tijd (LTi50) en de mortaliteit of het mogelijke effect van lage temperaturen op de ontwikkeling van poppen voor volwassenen te bepalen.  Bij 5 °C overleeft 90 % van de poppen na 64 dagen. Bij 0 °C na 64 dagen overleeft 70 % van de poppen. Bij - 5 °C is er na 1 dag slechts 55 % van de poppen die overleeft; na 32 dagen bij -5 °C overleeft geen enkele pop. Bij -10 °C na 16 dagen is er geen overleving meer; na 8 dagen overleeft 10 % van de poppen. Bij temperaturen van 0 ° C en -5 ° C (veel voorkomende Belgische winterse omstandigheden) zijn respectievelijk 86 en 9 dagen nodig om 50% sterfte te bereiken. Uit de Ltijd50-waarden kon afgeleid worden dat Belgische wintercondities (temperaturen) toelaten dat 90 % van de poppen overleeft gedurende de winter. Voor het onderzoek naar aestivatie (taak 3.4) werden poppen blootgesteld aan hoge temperaturen (22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 en 36°C) en verschillende periodes van blootstelling: 0, 1, 4, 8, 16, 32 en 64 dagen. Vervolgens werden poppen overgebracht naar 15 °C om de laagste letale tijd (LTi50) en hun mortaliteit te bepalen. Onze resultaten lieten zien dat de poppen goed (90%) overleefden bij 22 °C. Bij 26 en 28 °C was er een significante daling van de overlevingskans van de poppen. Bij temperaturen boven 28°C was er een zeer scherpe daling van de overlevingskans. De overlevingskans daalde met toenemende temperatuur en langere blootstellingsduur.De kennis verzameld tijdens de verschillende experimenten in deze taak gaf een beter beeld van het overwintering- en aestivatiegedrag en overleving van de preimineervlieg in Vlaanderen. De poppen lijken zowel in de zomer als in de winter bij zeer lage en hoge temperaturen quiescent te zijn. Het insect kan hier zowel de winter als de zomer overleven. Fluctuerende temperaturen helpen de vliegen overleven. Schommelende temperaturen in het veld kunnen de overlevingskansen van de pop vergroten (tijdens optimale periodes kunnen insecten warmte- of koudewonden veroorzaakt door extreme temperaturen herstellen). Werkpakket 4 Natuurlijke vijanden van preimineervlieg In dit werkpakket beoogden we potentiële natuurlijke vijanden van P. gymnostoma op te lijsten en hun mogelijke beheersingsimpact in te schatten. Halticoptera circulus is gekend als een potentiële natuurlijke vijand van mineervliegsoorten zoals Liriomyza spp. en Phytomyza gymnostoma. Deze endoparasiet parasiteert larven en poppen. Noch deze soort noch een andere natuurlijke vijand werden waargenomen tijdens de monitoring in 2016 en 2017. In het voorjaar van 2018 werden echter een paar parasieten die behoren tot de Hymenoptera en verschillende families zoals  Braconidae – Alysiinae, Ichneumonidae – Cryptinae, Braconidae – Aphidiinae, Proctotrupidae en Chalcidoidae op de vangplaten gedetecteerd. Hiervan zouden alleen de sluipwespen van Braconidae, Chorebus sp., preimineervlieg kunnen parasiteren. We konden de sluipwespen niet identificeren op soortniveau omdat er niet genoeg vrouwtjes werden gevonden. In 2018, 2019 en 2020 werden poppen verzameld in aangetaste velden. Deze poppen werden uitgekweekt bij ILVO en Inagro (Beitem) om te kijken of er poppen geparasiteerd zijn. Diglyphus isaea (Chalcidoidea: Eulophidae) en Halticoptera sp. (Hymenoptera: Chalcidoidea: Pteromalidae) werden gevonden in de poppen. Hun aantal was echter te laag in de natuur voor een goede beheersing van P. gymnostoma.  Vier commercieel beschikbare natuurlijke vijanden werden getest in het labo. Het Dacnusa systeem (Chorebus sibirica) en Diglyphus isaea had geen effect. Entomopathogene nematoden (EPN) Steinernema feltiae en S. carpocapsae gaven bevredigende resultaten in het labo. Ze konden de larven en de eerste, jongste, stadia van de poppen parasiteren. De toepassing van beide EPN-soorten op de preiplanten had echter geen enkel effect op de larven van P. gymnostoma. In de plant was de werking van deze nematoden waarschijnlijk niet goed doordat de larven en poppen van de preimineervlieg moeilijk bereikbaar zijn.   Werkpakket 5 Evaluatie van diverse beheersmaatregelenBinnen dit werkpakket testen we verschillende beheersmaatregelen tegen preimineervlieg. Bij de teelttechnische maatregelen (taak 5.1) onderzochten we in welke mate poppen in een preiafvalhoop en in een composthoop kunnen overleven. Preiafval composteren of op een hoop leggen, blijken goede maatregelen om de overwinterende poppen te vernietigen. Waarbij composteren de voorkeur geniet maar niet alle telers hebben de mogelijkheid om te composteren. Bij een preiafvalhoop kunnen poppen die zich aan de buitenkant van de hoop bevinden immers wel nog overleven. Het afdekken van de hoop met een afdekzeil is in het project niet uitgetest, maar zal mits goede afdekking een bijkomend effect hebben om de overlevingskans van de insecten te doen dalen. We geven de telers het advies om geen prei-afval meteen terug op het veld te brengen in geval van aantasting. Prei-afval verzamelen ze best om het te composteren of op een hoop te brengen en, bij voorkeur afgedekt, minimaal twee à drie maanden te laten liggen.De diepte van inwerken van prei-afval om ontluiking van vliegen te voorkomen werd niet meer in dit project onderzocht omdat Duits onderzoek aantoonde dat ploegen tot 30 cm diepte slechts een beperkte invloed had op het uitkomen van de vliegen. Op die diepte kwamen maar 33% minder vliegen uit de poppen vergeleken met een diepte van 10 cm.We vroegen ons af of bepaalde preirassen aantrekkelijker zijn voor preimineervlieg dan andere. In potproeven in de serre zagen we geen verschil in aantal voedingsstippen op de verschillende rassen. Op het veld namen we wel verschillen in aantasting waar tussen de verschillende rassen op het proefstation in Sint-Katelijne-Waver (PSKW), gelegen in de regio waar de druk van preimineervlieg het grootst is. Zowel in de rassenproef prei late herfstteelt als in de rassenproef winterprei op het PSKW toonden de rassen Oslo (Enza) en Pluston (Nunhems) zich sterk tegen aantasting door preimineervlieg. Verder zagen we ook een voorzichtige tendens dat rassen met een blekere bladkleur meer schade van preimineervlieg vertoonden.Naast voorgaande maatregelen werd ook het effect van afdekking onderzocht door het PSKW door proeven aan te leggen met verschillende afdekmaterialen. De bedoeling was om na te gaan of afdekken van prei met insectengaas of klimaatnet een afdoende bescherming biedt tegen aantasting van preimineervlieg. De verschillende materialen werden aangebracht voor de aanvang van de vlucht van preimineervlieg en werden pas verwijderd nadat de laatste vliegen werden waargenomen. Naast een beoordeling op schade door preimineervlieg werden ook kwaliteit, opbrengst en eventuele aantasting door trips of sleet beoordeeld. Er werden veldproeven aangelegd in vroege teelten van prei en in winterteelten. De proeven in vroege prei beoogden bescherming tegen de eerste vlucht van preimineervlieg, deze in winterprei tegen de tweede vlucht. De afdekkingen die getest werden zijn naast het Howicover klimaatnet diverse insectennetten getest: Ornata Addu, Ornata Light, Ornata Plus 135, Ornata Plus 80, Insectprotect 1.3, Insectprotect 0.8 en Tripsgaas. Alle afdekmaterialen bleken effectief en beperkten de schade significant in vergelijking met het niet afgedekte object. Het fijnmazige net Ornata Light met maaswijdte 0.6 mm op 0.66 mm is effectiever dan het koolvlieggaas Insectprotect 1.3 met grotere mazen van 1.3 mm op 1.3 mm.Een kanttekening is dat de afdekkingen de lichtinval beperken. Onmiddellijk na het verwijderen van de afdekkingen toonden vooral de planten onder de fijnmazige insectengazen een blekere bladkleur op het veld en werd bij de oogst een lagere opbrengst vastgesteld. Een kostenbatenanalyse werd opgemaakt voor het afdekken van prei. Tijdens de teelt worden kwalitatief positieve resultaten geboekt met zowel gewasbespuitingen als met gewasafdekkingen. De voornaamste bevindingen van de kosten-baten analyse zijn:- Drie gewasbespuitingen met effectieve bestrijdingsmiddelen zijn economisch het meest voordelig.- Afdekken met het Howicover klimaatnet komt qua kostprijs in de buurt van drie gewasbespuitingen met insecticiden.- Afdekken met het insectennet Ornata Addu (0.8*1mm) is beduidend duurder maar nog steeds economisch interessant (kost minder dan opbrengstverlies door plaag).Binnen taak 2 van werkpakket 5 was voorzien om de werking van verschillende insecticiden tegen de preimineervlieg te evalueren, in eerste fase op kleine schaal. In 2018 werd een eerste screening uitgevoerd door middel van een pottenproef op Inagro en PCG. De middelen met een goed resultaat werden geselecteerd voor verdere evaluaties. Om een goede aantasting te garanderen werd verder gewerkt met de kweek van ILVO, en dit in insectenkooien waarin potten met preiplanten werden gezet. In 2018 en 2019 hebben we verschillende middelen tegen de adulte vlieg getest. Voor de bestrijding van preimineervlieg is het belangrijk middelen in te zetten die worden opgenomen door de plant en een maagwerking hebben. Zo worden de vliegen getroffen tijdens het vormen van de voedingsstippen. Uit de proeven bleek dat Mesurol, Tracer, Benevia en Karate Zeon hieraan beantwoorden en effectief zijn. Middelen met alleen een contactwerking zijn minder interessant, omdat we het exacte moment van de vlucht nog niet kunnen bepalen. Het is echter de larve van de vlieg die de schade veroorzaakt. Daarom zijn we in 2019 gestart met kooienproeven om de efficiëntie van deze middelen tegen de larve te evalueren. Daarvoor werden vóór de behandeling de vliegen en preiplanten gedurende een week samen in een kooi geplaatst zodat de infectie kon gebeuren. Vervolgens werden de planten tweemaal behandeld (met een week interval). Na vier weken telden we tijdens een grondige eindbeoordeling het aantal larven en poppen. Niet alle proeven waren even succesvol (we ondervonden dat het belangrijk is om de proeven uitvoeren tijdens de natuurlijke vlucht van de preimineervlieg), maar we konden wel duidelijk afleiden dat Benevia (120 dagen regeling) en Mesurol (niet langer erkend) een goede werking hebben tegen de larven. Tracer heeft een middelmatig effect. Bij de laatste kooienproef op het PCG wilden we nagaan hoe lang na toepassing de middelen effect hadden op de adulten. Hiervoor werden de planten behandeld zoals in eerdere proeven en werden 1 uur, 7, 12 en 17 dagen nadien vliegen in de kooi gestoken. Enkele weken later voerden we een destructieve eindbeoordeling uit. Door wisselvallig weer, bleek ook de infectie wisselvallig verlopen te zijn. Daardoor is het moeilijk om duidelijke conclusies te trekken uit deze proef. Werkpakket 6 Validatie en disseminatie van geïntegreerde beheersstrategieën voor de preimineervliegAdviezen voor de beheersing van preimineervlieg werden opgenomen in de operationele waarnemings- en waarschuwingssystemen in de preiteelt: ‘Waarnemingen en Waarschuwingen’ (PCG, PSKW en Inagro) en de Waarschuwingsberichten Bio (Inagro) (taak 6.1). Dit zal in de toekomst ook verder gezet worden. Er werden ook gezamenlijke blogberichten geschreven die op de website van de praktijkcentra verschenen. Op deze manier werden preitelers en sectorgerelateerden makkelijk bereikt. De beheersmaatregelen die in werkpakket 5 werden getest en de resultaten daarvan, werden via demonstratieproeven, proefveldbezoeken en artikels naar telers gecommuniceerd (taak 6.2). Tijdens rondleidingen en overleg met de telers (taak 6.3) kwam het project vaak aan bod (zie collectief bereik). Verschillende artikels werden in vaktijdschriften gepubliceerd.Een abstract getiteld ""Seasonal occurrence and life cycle of the allium leaf miner (Phytomyza gymnostoma) in Belgium” werd mondeling voorgesteld op het 70e International Symposium on Crop Protection in Gent (22 mei 2018). Een ander abstract getiteld “Distribution, life cycle and overwintering ability of the allium leaf miner (Phytomyza gymnostoma) in Belgium” werd ook mondeling voorgesteld op de IOBC working Group ‘Integrated Protection of Field Vegetables’ meeting in Stratford-upon-Avon, UK (13th-16th October 2019). Twee abstracten, één getiteld “Rapid identification of the allium leaf miner by loop-mediated isothermal amplification (LAMP)” en een tweede “Efficacy of insecticides against allium leaf miner” werden geaccepteerd om te worden gepresenteerd op het 72e International Symposium on Crop Protection in Gent (19 mei 2020), maar het symposium is uitgesteld naar 18 mei 2021 vanwege COVID-19. Er werden twee wetenschappelijke publicaties geschreven met als titels: ‘Detection and identification of the allium leaf miner by loop-mediated isothermal amplification (LAMP)’ en ‘Overwintering and aestivation ability of the allium leaf miner, Phytomyza gymnostoma (Diptera: Agromyzidae)’. Deze publicaties zullen eind juli 2020 ingediend worden. " "Longitudinale, Spatiale en Spatio-Temporale modellering van klinische en epidemiologische data" "Ariel Alonso Abad" "Leuvens Biostatistiek en Statistische Bioinformatica Centrum" "Hiërarchische gegevens, met correlatie in ruimte en/of tijd, komen in verschillende domeinen voor. In klinische en epidemiologische studies, zoals bij niertransplantatiestudies, is dit het geval wanneer een aantal longitudinale markers samen worden waargenomen, vaak ook in combinatie met (terugkerende) gebeurtenistijden. In de context van infectieziekten, zoals door SARS-CoV-2 geïnduceerde COVID-19, impliceert het zoeken naar ""correlates of protection"" voor de werkzaamheid van vaccins de gezamenlijke modellering van een aantal merkers (bijv. gebaseerd op humorale en cellulaire immuniteit) en tijd tot infectie, in een multicentrische studie of multi-trial meta-analyse. Nog steeds op het gebied van SARS-CoV-2 is de gezamenlijke modellering van belangrijke epidemiologische indicatoren (bijv. totaal en bevestigde gevallen, positiviteit, ziekenhuisopnames, ICU-bezetting, mortaliteit) van belang. Dergelijke tijdreeksen maken, wanneer ze worden geanalyseerd op het niveau van voldoende kleine geografische eenheden (provincies, steden of statistische sector), een verfijnde analyse mogelijk met behulp van multivariate longitudinale, spatiale of spatio-temporale methoden. Hoewel er enige modelleringsinspanningen reeds zijn geleverd, is er nog veel werk nodig om modellen te formuleren die een goede beantwoording van de bijbehorende onderzoeksvragen mogelijk maken. Bovendien is er werk nodig om deze modellen rekenkundig stabiel en efficiënt te maken, en dus praktisch bruikbaar." "Kwantificeren van de landbouwproductiviteit bij milieuduurzaamheidsevaluaties: methodologische ontwikkelingen en toepassingen" "Jo Dewulf" "Vakgroep Groene Chemie en Technologie, Vakgroep Duurzame Organische Chemie en Technologie" "De stijgende vraag naar voedsel, veevoer en brandstof heeft de landbouw onder toenemende druk gezet, wat geleid heeft tot intensivering van de landbouw. Hoewel dit intensief landbouwbeheer geresulteerd heeft in een productiviteitstoename, ging dit ook gepaard met een grote waaier aan milieuproblemen. Intensief gebruik van de landbouwbodem tast de bodemkwaliteit aan en hierdoor staat het vermogen om ook op lange termijn nog biomassa te kunnen produceren op het spel. Bij het streven naar duurzame landbouw is dus een doordachte selectie van landbouwpraktijken nodig om de impact op het milieu te verminderen en tegelijkertijd een toereikende bodemkwaliteit, en dus ook productiviteit op lange termijn, te kunnen waarborgen. Levenscyclusanalyse (LCA) kan helpen om de duurzaamheid van landbouwpraktijken te beoordelen. Gezien LCA oorspronkelijk was ontwikkeld voor industriële processen, moeilijkheden (bv. variabiliteit tussen landbouwsystemen) en tekortkomingen (bv. Impact op lange-termijn productiviteit) bestaan bij het uitvoeren van een LCA met betrekking tot de landbouwsector. De algemene doelstelling van deze doctoraatsthesis is dan ook om inzicht te krijgen in een aantal van deze specifieke kenmerken die het uitvoeren van een LCA in de landbouwsector moeilijker maken en methodologieën te ontwikkelen om enkele van deze uitdagingen het hoofd te kunnen bieden. Op deze manier kan de duurzaamheid van landbouwpraktijken meer allesomvattend geëvalueerd worden, wat een belangrijke troef is in het streven naar meer duurzame landbouw.Deze doctoraatsthesis begint met een algemene inleiding (Hoofdstuk 1). Eerst wordt een beeld geschetst van de landbouwsector in Europa. Vervolgens worden de belangrijkste landbouwbeleidsmaatregelen besproken. Het beleid kan de keuzes die landbouwers maken met betrekking tot landbouwpraktijken (bv. vruchtwisseling, bemesting), in deze thesis verder aangeduid als land use practices (LUPs), sterk beïnvloeden. LUPs hebben een impact op de bodemkwaliteit, waarvoor bodemorganische stof (soil organic matter, SOM) een belangrijke indicator is. Daarom wordt als derde onderdeel in dit hoofdstuk ingegaan op de belangrijkste kenmerken van SOM en wordt het verband tussen SOM en gewasopbrengst besproken. In het vierde deel worden de verschillende stappen die nodig zijn om een LCA te kunnen uitvoeren, en de belangrijkste hiaten die momenteel een grondige evaluatie van de milieuduurzaamheid van landbouwsystemen verhinderen, besproken. Tot slot, om de voordelen van duurzame LUPs in LCA te kunnen evalueren, moet men rekening kunnen houden met de impact van landbouwpraktijken op de bodemkwaliteit en de ecosysteemdiensten (ecosystem services, ES) die door agro-ecosystemen worden geleverd. Een overzicht van de bestaande evaluatiemethodes en hun beperkingen wordt gegeven.Het doel van Hoofdstuk 2 is inzicht krijgen in een eerste complexiteit gerelateerd met LCAs met betrekking tot de landbouw, namelijk het feit dat landbouwsystemen gekenmerkt worden door een grote variabiliteit als gevolg van managementbeslissingen en lokale natuurlijke omstandigheden. Daarom hebben we de variatie in plantaardige productiesystemen bestudeerd en uitgewerkt voor korrelmaïs. Vier oorzaken voor variabiliteit worden onderscheiden: het beleid, landbouwpraktijken, het weer en innovatie. Voor elke factor worden scenario's uitgewerkt aan de hand van een emissie-georiënteerde (ReCiPe) en een grondstoffen-gebaseerde levenscyclusanalysemeetmethode (Cumulative Exergy Extraction from the Natural Environment, CEENE) om de milieuvoetafdruk te bepalen. Het beleid beperkt de bemestingsniveaus naargelang de bodemtextuur. Het grondstoffenverbruik blijkt lager te zijn voor de teelt op niet-zandgronden dan op zandgronden. De landbouwpraktijken lijken in mindere mate een invloed te hebben op de milieuvoetafdruk wanneer enkel met de resultaten van de CEENE rekening wordt gehouden. Maar keuzes gerelateerd aan het landbouwbeheer zoals bv. het type meststof hebben een groot effect op emissie-gerelateerde problemen (vb. eutrofiëring). De wisselende weersomstandigheden van jaar tot jaar leiden daarentegen tot grote verschillen in de milieuvoetafdruk. De beste milieuprestatie wordt verkregen door innovatie aangezien bijvoorbeeld plantenveredeling verondersteld wordt te resulteren in een gestaag stijgende opbrengst over een periode van 25 jaar. Tenslotte toont een vergelijking tussen de milieuvoetafdruk van graanmaïsproductie in Vlaanderen en een generieke databank, gebaseerd op Zwitserse landbouwpraktijken, het belang aan van het gebruik van lokale gegevens.In Hoofdstukken 3-5 wordt ingegaan op één van de belangrijkste tekortkomingen die momenteel in de LCAs voor de landbouw wordt geconstateerd: de gebrekkige integratie van het effect van LUPs op de bodemkwaliteit, en dus op de productiviteit op lange termijn. Om de evolutie van de organische koolstofvoorraad (soil organic carbon, SOC, SOM wordt vaak gemeten als SOC) in de bodem als gevolg van het bedrijfsbeheer en de respons van de productiviteit op die verandering in SOC te simuleren, worden respectievelijk de modellen RothC en EU-Rotate_N toegepast.In Hoofdstuk 3 introduceren we de indicator Agricultural Biomass Productivity Benefit of SOC management (ABB_SOC), die, op basis van het verbruik van natuurlijke grondstoffen (vb. mineralen, fossiele brandstof), een inschatting geeft van het netto-effect van de geleverde inspanningen om een betere bodemkwaliteit te bereiken. Hierbij ligt de nadruk op SOC. Eerst wordt een kader vastgesteld om de het verloop van de organische koolstofvoorraad als gevolg van beslissingen op het gebied van landbouwbeheer te beschrijven. Vervolgens wordt, indien de organische koolstofvoorraad lager is dan een gedefinieerde drempelwaarde, de mate waarin herstelmaatregelen nodig zijn gebruikt als maatstaf voor de ontstane SOC-verliezen. ABB_SOC-waarden worden dan berekend als de balans tussen enerzijds het verbruik van natuurlijke grondstoffen gerelateerd aan de productie (inclusief de grondstoffen nodig om de herstelmaatregelen uit te voeren), en anderzijds de gewenste output van plantaardige productiesystemen (de geoogste gewassen). De ontwikkelde indicator wordt toegepast op verschillende rotatiesystemen in Vlaanderen, waarbij verschillende herstelmaatregelen worden vergeleken. Uit de resultaten blijkt dat, in het algemeen, de voordelen opwegen tegen de inspanningen om het SOC-niveau te herstellen, hoewel de resultaten sterk afhangen van de toegepaste herstelmaatregelen.In Hoofdstuk 4 wordt onderzocht hoe de impact van LUPs op bodemkwaliteit in de LCA-methodologie in rekening kan gebracht worden. Momenteel zijn geen methodes beschikbaar die de verandering in SOC kwantitatief koppelen aan de productiviteit op lange termijn. We introduceren in dit hoofdstuk drie onderling afhankelijke indicatoren die zich langs de oorzaak-gevolgketen situeren en rekening houden met de impact van LUPs op bodemkwaliteit in relatie tot de area of protection natuurlijke grondstoffen. Halverwege de oorzaak-gevolgketen (midpoint) worden de indicatoren U+2018cumulatief tekort aan organische koolstofU+2019 (cumulativeSOC Deficit, cSOCD) en U+2018cumulatief verlies aan biomassaproductiviteitU+2019 (cumulative biomass productivity loss, cBPL) voorgesteld om respectievelijk de cumulatieve verliezen in SOC en opbrengst aan te geven als gevolg van de toegepaste LUPs. Aan het eind van de oorzaak-gevolgketen (endpoint) wordt de indicator U+2018extra landvereistenU+2019 (additional land requirement, ALR) ingevoerd om de behoefte aan extra landbouwareaal aan te geven die nodig is om de biomassa die niet geproduceerd wordt door de verandering in SOC voorraad, toch te kunnen produceren. Voor Vlaanderen worden karakterisatiefactoren ontwikkeld, waarbij verschillende bodemtexturen, initiële organische koolstofvoorraden, gewasrotatiesystemen en LUPs in beschouwing genomen worden. Doordat de referentietoestand gebaseerd is op duurzame LUPs, kan de ontwikkelde methode als beslissingsondersteunend instrument dienen voor een duurzamere landbouw.In Hoofdstuk 5 wordt onderzocht welke invloed het beleid kan hebben op de lange-termijn landbouwproductiviteit door landbouwers te stimuleren of te ontmoedigen om bepaalde LUPs toe te passen. We introduceren zes beleidsstrategieën voor de Vlaamse landbouwsector, elk gekenmerkt door een eigen mix van LUPs. Drie strategieën laten ons toe om de impact van het Gemeenschappelijk Landbouwbeleid (GLB) van de Europese Unie uit het verleden te evalueren, terwijl de andere zich richten op de toekomst: één strategie gaat in op het potentieel van het GLB, terwijl twee strategieën focussen op mogelijkheden om compost te gebruiken. Om de impact van het beleid op de lange-termijn productiviteit te evalueren, wordt gebruik gemaakt van de indicatoren cSOCD en cBPL. Ook de voetafdruk in termen van grondstoffenverbruik wordt berekend, om zo een verschuiving van de milieu-impact te voorkomen. Verschillende landbouwbedrijfssystemen (farm management systems, FMS) worden onderscheiden, elk gekenmerkt door een specifieke combinatie van bedrijfstype, landbouwregio, gewasrotatiesysteem en mesttype. De resultaten benadrukken de impact van het beleid op de toename in productiviteit op lange termijn. Bovendien lijkt het gebruik van extra compost veelbelovend: het resulteert in een hogere opbrengst en wordt gekenmerkt door een lager grondstoffenverbruik. Aangezien de resultaten per FMS verschillen, is een gedifferentieerde aanpak aan te bevelen wanneer specifieke LUPs worden gestimuleerd in de context van duurzame landbouw.Een laatste uitdaging met betrekking tot het uitvoeren van een LCA in de landbouwcontext die in deze doctoraatsthesis bestudeerd wordt, is het feit dat LCAs zich traditioneel enkel richten op de geoogste producten, terwijl het aanbod van andere ES geleverd door het landbouwsysteem niet in rekening wordt gebracht. Dit draagt ertoe bij dat, op basis van LCA-resultaten, producten geteeld door conventionele landbouwpraktijken vaak positiever worden beoordeeld dan biologische levensmiddelen/diervoeders/brandstoffen. Namelijk wanneer de milieu-impact uitgedrukt wordt per kg geproduceerd voedsel, wegen de lagere opbrengsten gerapporteerd voor biologische landbouwsystemen vaak zwaarder door dan het gebruik van milieuvriendelijkere praktijken. In Hoofdstuk 6 stellen we een methode voor om de milieu-impact te verdelen over alle geleverde ES. Deze procedure is gebaseerd op de capaciteit van een agro-ecosysteem om ES te leveren, dewelke verschillend is voor conventionele en biologische systemen. Door rekening te houden met alle ES geleverd door een agro-ecosysteem, kan de ecologische duurzaamheid van biologisch en conventioneel geproduceerd voedsel eerlijk vergeleken worden. Na het toepassen van deze methode blijkt dat voor ongeveer de helft van de bestudeerde voedingsproducten (waaronder aardappelen, maïsU+2026) de biologische teelt de voorkeur krijgt op de conventionele teeltmethoden.Tot slot worden in Hoofdstuk 7 de belangrijkste conclusies en enkele suggesties voor toekomstig onderzoek gepresenteerd. Drie mogelijkheden worden besproken: de ontwikkeling van een meer alomvattende bodemkwaliteitsindicator, een betere evaluatie van de impact van LUPs op de lange-termijn productiviteit in verband met de area of protection natuurlijke grondstoffen en de uitbreiding van de toepasbaarheid van de integratie van ES in LCA. Ten slotte wordt het werk dat uitgevoerd werd in deze doctoraatsstudie in een breder perspectief geplaatst: enerzijds wordt naar landbouw als onderdeel van het ecosysteem op globaal niveau gekeken en anderzijds naar de samenhang tussen het beleid en landbouw." "Pathways of astrocyte-neuron: interacties en ziektemodificerende therapieën bij neurologische aandoeningen" "Jacques De Keyser" "Farmacologie, Neuroprotectie & Neuromodulatie" "Pathways of astrocyte-neuron: interacties en ziektemodificerende therapieën bij neurologische aandoeningen" "Verwijdering van micropolluenten met biogeaugmenteerde bewegend-bed biofilmreactoren en nanofiltratie" "Wiebe Matthijs de Vos, Ivo Vankelecom" "Afdeling: Centrum voor Oppervlaktechemie en Katalyse, Membraanscheidingen, Adsorptie, Katalyse en Spectroscopie voor Duurzame Oplossingen (cMACS)" "SamenvattingDe groeiende wereldbevolking, verstedelijking, economische welvaart en gebruik van chemicaliën, resulteert in een toenemende druk op de waterkwaliteit. Hierdoor wordt vandaag de dag meer en meer gebruik gemaakt van water afkomstig van afvalwaterzuiveringsinstallaties. De kwaliteit hiervan beantwoordt aan de meeste normen, maar de aanwezigheid van micropolluenten (MP) in het behandeld water blijft een groot probleem. Om het vrijkomen van dergelijke componenten in oppervlaktewateren te verminderen, is de ontwikkeling van tertiaire waterzuiveringstechnologieën in het afgelopen decennium merkbaar toegenomen.  Om deze kennis te ondersteunen en verbreden, werden in dit proefschrift twee geavanceerde behandelingen bestudeerd om hun potentieel voor de eliminatie van verschillende MPs uit conventioneel behandeld afvalwater te onderzoeken: “bioaugmented moving bed biofilm reactors (MBBRs)” en “polyelectrolyte multilayer (PEM)-gebaseerde nanofiltratie (NF) membranen”.Tertiaire MBBRsDrie identieke van glas gemaakte MBBRs met elk een effectief volume van 3,1 L, werden continu gevoed met synthetisch, MP aangerijkt secundair behandeld afvalwater. Deze drie systemen opereerden in parallel bij omgevingstemperatuur. In Hoofdstuk (II) wordt het effect van de veranderingen van ‘organic loading rate’ (OLR) op de pseudo-eerste orde afbraakconstante (kbiol) van MPs, na afzetting van een dunne biofilm (~ 100 μm) op het oppervlak van Z-carriers, in steady-state geëvalueerd. Voornamelijk Diclofenac, Naproxen en 4n-Nonylfenol werden afgebroken door het biologisch afbraakmechanisme van co-metabolisme, terwijl de biodegradatie van 17ß-Estradiol onder controle werd gehouden door het mechanisme van competitieve inhibitie. Vervolgens werden de individuele bijdragen van biofilm en gesuspendeerde biomassa tot de abiotische en biotische verwijdering van MPs verder onderzocht. Meer in detail werd de abiotische verwijdering van MPs toegeschreven aan de sorptie op de biologische vaste stoffen, aangezien noch fotodegradatie noch verdamping de MPs konden verwijderen. In deze context werden Naproxen, Diclofenac, 17ß-Estradiol en 4n-Nonylfenol (gerangschikt in toenemende volgorde van hydrofobiciteit) abiotisch verwijderd met respectievelijk 2.8%, 4%, 9.5% en 15%. Hiermee verband houdend, werd de sorptie van MPs op de gesuspendeerde biomassa ongeveer twee keer meer waargenomen dan op de biofilm. Bij het vergelijken van de abiotische en biotische aspecten, presteerde biotische verwijdering beter voor alle verontreinigende stoffen. Zodoende werden Diclofenac, Naproxen, 17ß-Estradiol en 4n-Nonylfenol biologisch afgebroken voor respectievelijk 72.8%, 80.6%, 84.7% en 84,4%. Voor alle MPs waren hun kbiol -waarden in de biofilm hoger dan in vergelijking met de gesuspendeerde biomassa, vooral voor het recalcitrante Diclofenac. In een volgend deel (Hoofdstuk (III)) werd bepaald of  bacteriële bioaugmentatie van tertiaire MBBRs de verwijdering van MPs succesvol kon verbeteren. De gebruikte Pseudomonas fluorescens stam heeft de eigenschap om zowel een biofilm te vormen als industriële polluenten te metaboliseren. Twee van de drie MBBRs werden met P. fluorescens geïnoculeerd (door middel van een nieuw protocol) en functioneerden onder dezelfde voorwaarden als de derde niet-biogeaugmenteerde (controle) MBBR (cMBBR). Uit de resultaten van de DNA-extractie en qPCR bleek dat de abundantie van P. fluorescens in de biofilm en vloeibare fase afnam met de tijd. Ondanks dit resultaat vertoonden de biogeaugmenteerde MBBRs (bMBBRs) voor alle target-MPs hogere kbiol (pseudo-eerste orde afbraakconstante) waarden dan de cMBBR, gecombineerd met een hoge biotische verwijdering van 84.5%, 90.4% en 95.5% voor Diclofenac, Naproxen en 4n-Nonylfenol respectievelijk. In tegenstelling tot de kbiol waarden toonde de MP-sorptie op de biologische vaste stoffen na bioaugmentatie een daling omdat de bovengenoemde componenten abiotisch werden verwijderd met 0.4%, 1.1% en 3.9% respectievelijk. In vergelijking met bMBBRs werd in cMBBR een hogere abiotische verwijdering (2.8-15%) en slechts 10% lagere biotische verwijdering waargenomen. Het toch bereiken van een hoog niveau voor biotische verwijderingen in de cMBBR kan te wijten zijn aan aanpassingsprocessen. Indien de biomassa niet goed zou aangepast zijn om MPs af te breken, dan zou het efficiëntie-verschil tussen de bMBBRs en cMBBR waarschijnlijk groter geweest zijn. Ondanks het feit dat bMBBRs een hoog potentieel hebben voor de verwijdering van MPs (met in het bijzonder Diclofenac), heeft deze technologie nog meer onderzoek nodig om uitdagingen, zoals het verhogen van de overlevingskans en het behoud van geënte stammen, te overwinnen. In het algemeen zorgt de goede MP-verwijdering in dit tertiaire MBBRs systeem voor een krachtige technologie die zowel bio-routes van co-metabolisme als concurrerende inhibitie ondersteunt, alsook de abiotische bestrijding. Verdere optimalisatie van de bMBBRs lijkt dan ook beloftevol om een stap te zetten in de richting van volledige eliminatie van MPs. PEM-gebaseerde NF-membranenPEMs worden gemaakt door alternerend tegengesteld geladen polyelektrolyten op dragers te adsorberen via de ‘layer by layer’ (LbL) techniek. Deze kunnen dan dienen als regenereerbare coatings met controleerbare fysicochemische eigenschappen, zoals oppervlaktelading, hydrofiliciteit en dikte. Met deze techniek werden PEMs van twee zwakke polyelektrolyten, i.e. poly(allylamine hydrochloride) (PAK) en poly(acrylic acid) (PAA), op het oppervlak van ultrafiltratie (UF) dragers gecoat om PEM-gebaseerde NF-membranen te verkrijgen. Voor de oppervlaktemodificatie werden twee soorten UF-steunlagen gebruikt: hollevezel silica (HFS) (Hoofdstuk (IV)) en vlakkeplaat polyacrylonitrile (PAN) membranen (Hoofdstuk (V)) . In deze thesis werd gebruik gemaakt van een zwak-PEM-gebaseerd NF-membraan. Dit type is gekend als een gemakkelijk te reinigen membraan met lage zoutretentie en hoge verwijdering van MPs uit secundair behandeld afvalwater.Voorafgaand aan de filtraties werden gewenste aantallen (PAH/PAA) dubbellagen afgezet op een modeloppervlak (met plasma behandelde silicium wafers) om de coatingsomstandigheden (pH en ionische sterkte) te optimaliseren en om tevens het opbouwsysteem en de hydratatie van multilagen te onderzoeken. Op de UF-steunlagen werden vervolgens door dip-coating de geoptimaliseerde PEMs afgezet en getest op permeabiliteit, zout- en MP-retentie. In het geval van gemodificeerde PAN-membranen werden de PEMs ook nadien behandeld door thermisch en/of zout ‘annealing’. Na filtratie van MP-beladen afvalwater, werd de ‘sacrificial’ reiniging van het vervuilde membraan onderzocht.Zoals bewezen in Hoofdstuk (IV) toonden de met lagere ionische sterkte (5mM NaNO3) bereide (PAH / PAA)6 multilagen een lagere hydratatie en bijgevolg een betere retentie van zouten en MPs dan de PEMs die bereid werden met hogere ionische sterkte (50 mM NaNO3). Vooraleer het membraan verzadigd is, was de retentie voor het hydrofobe 4n-Nonylfenol de hoogste, gevolgd door Diclofenac, Ibuprofen en Naproxen respectievelijk. Dit toont aan dat de retentie gedomineerd wordt door hydrofobe interacties waarbij meer hydrofobe MPs beter adsorberen op het membraanoppervlak.Eenmaal het membraan is verzadigd, zorgde het verzwakken van de hydrofobe interacties voor daling van MP-retentie. MPs met grotere molecuulgewichten werden hierbij beter tegengehouden, wat retentie op basis van grootte aantoonde. Ook de sterke relatie tussen MP-retentie en de ‘minimum projection area’ (MPA) van deze MPs bewijst het belang van ruimtelijke dimensies in de uiteindelijke retentie. In tegenstelling tot bestaande hoog-efficiënte, commerciële NF-membranen die zowel zouten als MPs in hoge mate kunnen tegenhouden, kon een membraan bekomen worden met een zeer lage zoutretentie (NaCl ~ 17%) in combinatie met een goede MP-retentie, i.e. respectievelijk 77%, 56%, 44% en 70% voor Diclofenac, Naproxen, Ibuprofen en 4n-Nonylfenol. De lage retentie van zouten leidt tot een concentraat met laag zoutgehalte, wat de biologische behandeling van MPs vergemakkelijkt. Bovendien wordt de saliniteitsbalans van het effluent door dergelijke membranen niet merkbaar verstoord, waardoor het gefilterde effluent veel beter geschikt is voor irrigatiewater.De invloed van de PEM-nabehandeling (thermisch en zout annealing) werd geëvalueerd in Hoofdstuk (V). Hoewel PEMs compacter en minder gehydrateerd worden bij hogere temperatuur, werd geen verbeterde retentie van ionen waargenomen. Na zoutbehandeling in 100 mM NaNO3 werd voor (PAH/PAA)15 membranen de hoogste ionretentie waargenomen in combinatie met een beperkte afname in waterpermeabiliteit. De retentie van MPs werd bestudeerd gedurende een filtratietijd van 54 uur. Terwijl de filtratie doorging tot de membranen verzadigd waren, werd een toename van membraanhydrofiliciteit waargenomen. Ook kwam de rol van moleculaire en ruimtelijke dimensies voor MP retentie opnieuw naar voor. De retentie van MPs voor zout-behandelde membranen was hoger dan voor niet-behandelde (52-82% tegen 43-69%), gecombineerd met een lage NaCl-retentie (~ 25% tegen ~ 17%). Bovendien konden dergelijke membranen makkelijk gereinigd worden dankzij de ‘sacrificial coating’. De vervuilde membranen werden behandeld met een reinigingsproduct om zowel de oppervlaktevervuilende stoffen als de ‘sacrificial’ PEM-coating los te maken, zonder gebruik te maken van enige afschuifkrachten. Deze benadering kan inzake energieverbruik, een meer milieuvriendelijke aanpak zijn dan de conventionele terugspoelmethode.Uit de resultaten van dit onderzoek kan besloten worden dat voor zwakke-PEM-gebaseerde NF-membranen een hoge verwijdering van MPs gecombineerd kan worden met de productie van een zoutarm concentraat. Daaropvolgend kunnen dergelijke PEM-membranen gemakkelijk worden gereinigd zonder enig gebruik te maken van fysieke krachten. Dit alles resulteert in een beloftevolle technologie voor geavanceerde afvalwaterzuivering." "Renforcement du système de santé pour assurer la continuité des services et laccès aux soins des populations vulnérables dans le contexte COVID 19 en République de Guinée" "Wim Van Damme" "Departement Volksgezondheid, Beheer, Gezondheidsbeleid, ITG-DRC-dienst" "Renforcer le système de santé à Conakry, Kindia, Mamou et Labé afin d’assurer la continuité des soins et l’accès aux soins des populations vulnérables dans le contexte Covid-19 et post-Covid. IMT assure un appui scientifique au projet afin de documenter de façon solide l’effet de l’action. Les services envisagés consistent d’une part dans la collecte et l’analyse des données de routine et d’autre part dans la conduite d’études solides portant sur les deux résultats attendus de cette action. Ce volet ‘recherche’ du projet permettra ainsi de tirer des conclusions pour une mise à l’échelle et contribuera à nourrir le dialogue sur la politique nationale avec le Ministère de la Santé. La recherche comprend deux lots, un par résultat attendu du projet : - Lot ‘santé’ : L’impact de la pandémie SARS-CoV-2 sur l’utilisation des services et les mesures prises pour garantir la continuité- Lot ‘protection sociale’ : la perception de la population de l’effet du COVID-19 sur le fonctionnement des services et sur leur capacité de payer pour les soinsLes méthodes mixtes de recherche impliquant les méthodes quantitatives et qualitatives avec la possibilité de triangulation des données seront utilisées." "Effect of lactoferrin on pediatric infections" "Jan Jacobs, Jan Jacobs" "Tropische Bacteriologie" "Every year ≈ 6 million children younger than 5 years of age die, almost exclusively in low and middle-income countries. The main causes of death are neonatal problems (44%), pneumonia (13%) and diarrhea (9%) (Liu 2015). One third of all deaths are associated with malnutrition. Among those surviving, many suffer with long-term consequences in growth and development. Multiple preventive interventions have been designed to decrease mortality and disability in children. Among these, early and exclusive breastfeeding is one of the most important interventions to reduce neonatal and infant mortality (Walker, 2011). Breastfeeding is the most cost-effective intervention for protecting children against diarrhea and all causes of mortality (Jones, 2003). Human breast milk helps protect infants by serving as a source of nutrition uncontaminated by pathogens in addition to protection due to its multiple anti-microbial, anti-inflammatory and immunoregulatory components (Walker, 2010). Lactoferrin is one of the major factors responsible for these protective effects. This iron binding glycoprotein is found in most exocrine secretions including milk, tears, saliva, intestinal mucus and genital secretions, as well as the specific granules of neutrophils. The main biological properties of lactoferrin that contribute to its physiological functions are its high affinity for iron and its cationic character which is responsible for its ability to bind various cells, nucleic acids, proteins and other molecules (Baker, 2012). Lactoferrin protects against bacteria in a variety of ways: it sequesters iron that is essential for bacterial growth; binds to LPS on the cell surface, disrupting the bacterial cell membrane; peptide fragments (lactoferricin) are bactericidal in vitro (Brock, 2012). Lactoferrin reduces inflammation by decreasing production of tumor necrosis factor alpha and other proinflammatory molecules, and by regulating the immune response, protecting against severe inflammation related to infection and septic shock (Vogel, 2012).My early research has focused on the mechanisms of action of lactoferrin on enteric pathogens. We have demonstrated that lactoferrin impairs function of surface expressed virulence factors, by disruption of the type III secretory system of enteropathogenic E. coli (EPEC) (Ochoa, 2003). Lactoferrin inhibits enteroaggregative E.coli (EAEC) aggregative adherence “stacked-brick pattern” and biofilm formation (Ochoa, 2006). Lactoferrin decreases the ability of pathogens to adhere or to invade mammalian cells by binding to, or degrading, specific virulence proteins (Ochoa, 2009). We have demonstrated that lactoferrin has a protective effect on enteric infections in several animal models. We found that lactoferrin protects rabbits from Shigella flexneri-induced inflammatory enteritis (Gomez, 2002), and protects against Salmonella ser. Typhimurium infection in mice, reducing the severity, mortality and the degree of inflammation of this infection (Mosquito, 2010). Lactoferrin decreases fluid accumulation in the mice ileal loop model induced by cholera toxin (Rivera, 2013). Based on these preliminary in vitro and animal studies, we hypothesize that lactoferrin given as an oral supplement to infants in resource-limited settings will improve their health by mimicking its protective roles in breast milk, decreasing the incidence and severity of common pediatric infections due to its antimicrobial and immunomodulatory properties. This PhD proposal will focus on lactoferrin effect on enteric and neonatal infections; it will have five chapters; the first two are based on previous and already published work, and the other three chapters are on ongoing and new work." "EU-CHINA Hefboom voor IPM Demonstratie" "Guy Smagghe" "Vakgroep Plant en Gewas, Vakgroep Gewasbescherming, French National Institute for Agricultural Research, University of Turin, CARREFOUR (CHINA) MANAGEMENT & CONSULTING SERVICE CO, LTD, Imperial College London, BINAB BIO-INNOVATION AB, University of Lleida, Association de Coordination Technique Agricole, Institute of Plant Protection, BEIJING NUOYA AGRICULTURE DEVELOPMENT CO. LTD, Oxitec (United Kingdom), Zhejiang University, INTERDIS, INRA Transfert (France), AGROBIO SL, Institute for Research and Technology in Food and Agriculture, Venice International University" "Er zijn duurzamere methoden voor plaagbestrijding nodig om de negatieve effecten van pesticiden op de menselijke gezondheid en het milieu te verminderen. Het algemene doel van EUCLID is bij te dragen aan het veiligstellen van de voedselproductie voor de groeiende wereldbevolking en tegelijkertijd duurzame productiebenaderingen te ontwikkelen voor gebruik in de Europese en Chinese landbouw. De keuze van de gewassen die van belang zijn voor EUCLID, d.w.z. verse tomaten, tafel- en wijndruiven en bladgroenten (sla, kool, enz.), is gebaseerd op hun economisch belang voor zowel de Europese als de Chinese groente- en fruitproductie, maar ook voor hun voorbeeld in het vertegenwoordigen van verschillende productiesystemen (veld- + kasgroenten en houtachtige vaste plant). Dit betekent dat de oplossingen van het project kunnen worden gebruikt als modellen voor het ontwikkelen van soortgelijke acties voor andere gewassen."