Titel Promotor Affiliaties "Korte inhoud" "De integratie van cohort-afgeleide moleculaire en klinische informatie ter verbetering van precisie oncologie" "Kathleen Marchal" "Vakgroep Plantenbiotechnologie en Bio-informatica" "Moleculaire en klinische data zijn reeds beschikbaar voor publieke tumor cohorten, en zullen zeer waarschijnlijk in de nabije toekomst hun intrede maken in de kliniek. De integratie van dergelijke data biedt mogelijkheden om gepersonaliseerde geneeskunde te verbeteren, maar is niet triviaal. Daarom zullen we methoden ontwikkelen en toepassen om cohort-afgeleide data te analyseren en te gebruiken in de context van drug-gebaseerde precisie-oncologie." "Systeemgebaseerde weergave van melanoomvoortgang: naar nieuwe diagnostische (en therapeutische) toepassingen" "Joost van den Oord" "Translationeel Cel- en Weefselonderzoek" "Worldwide figures show that there were 160,000 incidences of melanoma in 2002, whilst 39,000 died from the disease. These upward trends are worrying, as malignant melanoma is one of the most difficult cancers to treat, due to its ability to spread quickly and its resistance to standard chemotherapeutic agents. In order to counteract this trend, targeted therapies that inhibit melanoma metastasis are required. The aim of SYS-MEL is to identify and validate prognostic and predictive biomarkers for melanoma, and to model the predictive value of these biomarkers in determining the efficacy of melanoma therapies. The central objective is to bring together four European academic institutes and two SMEs to develop 3 prognostic/predictive biomarker assays for melanoma. 3 core areas of interest are epigenetics, signalling pathways in melanoma and systems biological approaches for predicting chemotherapy responses. SYS-MEL will have three main elements:Epigenomic and protein expression analysis of melanoma tissue, to validate an epigenomic signature initially identified in the FP7-funded programme Target-MelanomaIn silico modelling and prediction of patient responses to decarbazine DTIC using both in vitro analysis of apoptotic pathways and a novel systems biology approach, incorporating mathematical systems modelling, quantitative biochemistry and cell biologyInvestigating the components of the P-Rex1 pathway that are involved in driving the migration of melanoblast cells, and thus the progression of metastasis, incorporating a computational system tailored to model complex signalling pathways.This approach will enable us to identify prognostic and predictive biomarkers for melanoma, and to develop a powerful computational modeling approach to predict disease progression and patient responses to treatment." "Ontwikkeling van een in situ padweg analyse systeem voor spatiale proteomie en gepersonaliseerde kankertherapie" "Francesca Bosisio" "Dynamische Systemen, Signaalverwerking en Gegevensanalyse (STADIUS), Translationeel Cel- en Weefselonderzoek" "Pathologische beoordeling bij kankerpatiënten is essentieel om de juiste diagnose te bepalen, wat een aanzienlijke invloed heeft op de prognose en het succes van hun therapeutisch plan. De recente introductie van ruimtelijke proteomics-technieken stelt pathologen in staat om een toenemend aantal vermeende biomarkers te evalueren op het niveau van de individuele cel. Deze ‘single-cell’ analyse heefPathologische beoordeling bij kankerpatiënten is essentieel om de juiste diagnose te bepalen, wat een aanzienlijke invloed heeft op de prognose en het succes van hun therapeutisch plan. De recente introductie van ruimtelijke proteomics-technieken stelt pathologen in staat om een toenemend aantal vermeende biomarkers te evalueren op het niveau van de individuele cel. Deze ‘single-cell’ analyse heeft uiteindelijk de ruimte gecreëerd om de fijne biologische dissectie van de tumor te bereiken die nodig is voor precisiegeneeskunde. Onze groep heeft, in samenwerking met Europese partners, een nieuwe tool ontwikkeld genaamd 'Multiple Iterative Labelling by Antibody Neodeposition' (MILAN), die het mogelijk maakt om meerdere (> 70) eiwitten in een enkele weefselsectie te analyseren met een ongekende resolutie (‘single-cell’ niveau). Ondanks het potentieel van ruimtelijke proteomics, zijn de toepassingen ervan nog niet benut door de wetenschappelijke gemeenschap. Tot op heden zijn er in de literatuur geen methoden beschikbaar die zijn gebaseerd op ruimtelijke proteomics om de activiteit van biologische routes in situ te meten. Het vermogen om pathway-activiteit te evalueren bovenop andere fenotypische en functionele kenmerken op eencellig niveau in een ruimtelijke context, zou echter een grote bijdrage leveren aan ons begrip van de verschillende relaties tussen de celtypen aanwezig in tumorweefsel. Daarom zal ik binnen dit project een methode ontwikkelen om specifieke pathway-activiteiten op enkelvoudig celniveau te schatten en deze informatie te gebruiken om kankerpatiënten te classificeren. Als case study zal ik de activiteit van HLA-DR analyseren, die afwijkend tot expressie kan komen in melanoomtumoren, en verschillende paden binnen en rond de tumorcellen kan activeren zoals geïdentificeerd door voorlopige bulk-RNA-sequentieanalyse. Om dit doel te bereiken, zal ik me eerst concentreren op het belangrijkste en meest uitdagende aspect van dit ambitieuze en innovatieve project: het integreren van ruimtelijke informatie van individuele cellen in weefselcoupes met hun eiwitexpressie in pathway-activiteit scores. Om dit te laten gebeuren, moeten enkele fundamentele stappen worden bereikt: (1) identificeren en valideren van de meest betrouwbare antilichamen die de eiwitten meten die aanwezig zijn in de HLA-DR-route en zijn interactoom; (2) deze inzichten integreren bovenop reeds beschikbare fenotypische en functionele markers die worden gebruikt om elk celtype in het weefsel te identificeren; (3) deze informatie gebruiken om de activiteit score van individuele cellen af te leiden die verband houden met de HLA-DR-route; (4) Deze cel-activiteit score integreren in een ruimtelijke context om scores van route- / netwerkactiviteit af te leiden; en (5) deze bevindingen correleren met klinische kenmerken van de opgenomen patiënten." "Een alternatieve teststrategie voor de fish early life-stage test op basis van het adverse outcome pathway (AOP) framework" "Dries Knapen" "Veterinaire fysiologie en biochemie" "In dit project wordt een alternatieve teststrategie ontwikkeld om het aantal fish early life-stage tests te verminderen, een test die gebruikt wordt voor het inschatten van chronische toxiciteit van chemische stoffen. Hierbij wordt gebruik gemaakt het het adverse outcome pathway (AOP) framework om gericht in vitro assays en alternatieve 120 hpf (hours post fertilization) ZFET (zebrafish embryo acute toxicity test) tests te ontwikkelen. De belangrijkste onderzoeksvraag is in welke mate een AOP-gebaseerde benadering een voldoende grote mechanistische basis vormt om dergelijke assays te selecteren en te ontwikkelen, zodat chronische FELS-toxiciteit voorspeld kan worden. Een dergelijke strategie leidt finaal tot een verminderd gebruik van proefdieren in de milieurisico-evaluatie." "Geneesmiddel-geïnduceerde cholestase: Een mechanistische exploratie van de hepatische galzout dispositie" "Pieter Annaert" "Farmacotechnologie en Biofarmacie" "Geneesmiddel-geïnduceerde levertoxiciteit (Drug-induced liver injury, DILI) is de meest voorkomende reden voor het van de markt halen van geneesmiddelen (Xu et al., 2004; Atienzar et al., 2016). Het vormt als dusdanig een groot risico voor de gezondheid van de patiënt, maar ook voor de farmaceutische industrie. Gedurende niet-klinische toxiciteitsonderzoeken is er een gebrek aan de identificatie van geneesmiddelen die DILI kunnen veroorzaken, hetgeen ernstige problemen vormt voor de farmaceutische industrie. De huidige niet-klinische in vivo dierproeven kunnen DILI niet betrouwbaar detecteren aangezien verscheidene DILI mechanismen verschillen tussen dieren en mens. Bijgevolg en daarbij ook rekening houdend met het 3R principe (replacement, refinement, reduction), heeft het niet-klinisch toxiciteitsonderzoek als doel de conventionele in vivo dierproeven te vervangen en betrouwbare in vitro methoden te implementeren. Deze in vitro methoden zijn cruciaal voor de nauwkeurige voorspelling en screening van geneesmiddelen die DILI kunnen veroorzaken. Helaas is de zoektocht naar de ontwikkeling van zulke nieuwe modellen of de optimalisatie van de huidige in vitro modellen ook nog steeds belemmerd door de beperkte mechanistische kennis met betrekking tot DILI. Daarom is het cruciaal om ons begrip over de toxiciteitsmechanismen van DILI te vergroten en om als dusdanig onze kennis over DILI te verbeteren.Eén van de belangrijkste vormen die betrekking heeft tot DILI is geneesmiddel-geïnduceerde cholestase (Drug-induced cholestasis, DIC). DIC maakt meer bepaald deel uit van ongeveer de helft van de DILI cases uit. DIC wordt veroorzaakt door een storing in de galzout homeostase, wat resulteert in een pathologische accumulatie van galzouten in de lever die uiteindelijk leverschade teweeg brengen. Daarom is het belangrijk dat de pathways die verantwoordelijk zijn voor het behoud van de galzout homeostase in vivo, worden nagebootst in een in vitro model. Tot nu toe werd de inhibitie van de Bile Salt Export Pump (BSEP) aangenomen het enige mechanisme te zijn met betrekking tot DIC. Aangezien de galzout homeostase een complexe wisselwerking vormt tussen verscheidene andere hepatische transport proteïnes en metaboliserende enzymes, groeit het belang van een meer uitgebreide mechanistische kennis over andere oorzaken van DIC, afgezien van BSEP inhibitie. Bovendien zal een verbeterde kennis over de verschillende aspecten van de galzout homeostase onze perceptie verruimen voor de ontwikkeling van meer geavanceerde in vitro en in silico modellen.Het overkoepelende doel van het huidige proefschrift was gericht op het mechanistisch begrijpen van interferenties in de galzout homeostase, veroorzaakt door geneesmiddelen. Derhalve werden levercellen van rat of humane oorsprong in een sandwich-configuratie (tussen twee lagen collageen; SCRH of SCHH) aangewend als in vitro model om de galzout dispositie in vitro na te bootsen. Dit model bevat alle lever-specifieke functies, samen met het behoud van hepatische transport proteïnes en metabolische enzymes. In dit opzicht werd een door onze onderzoeksgroep eerder ontwikkeld in vitro DIC systeem geoptimaliseerd en gevalideerd met behulp van een bredere set aan (niet)-lever toxische componenten (Doelstelling 1). Dit in vitro DIC systeem is gebaseerd op de incubatie van een cholestatische component met een fysiologisch galzout mengsel, teneinde de vorming van ureum te meten om zo de cel functionaliteit te bepalen. In een volgende fase werd dit in vitro DIC systeem geïmplementeerd om als mechanistisch platform te dienen zodanig de huidige kennis over de rol van andere hepatische transport proteïnes in DIC te verbeteren (Doelstelling 2). Het onderzoek in huidig proefschrift heeft getracht een antwoord te geven op specifieke onderzoeksvragen:Kunnen zowel gecryopreserveerde als vers-geïsoleerde cellen worden gebruik in het in vitro DIC systeem? (Hoofdstuk 3; onderdeel van Doelstelling 1)Kunnen cholestatische verbindingen op betrouwbare wijze voorspeld en vertaald worden naar een risico voor DIC in vivo, gebruikmakende van het in vitro DIC systeem? (Hoofdstuk 4; onderdeel van Doelstelling 1)Welke mechanismen zijn betrokken bij de stimulatie van OATP1B1-gemedieerde opname in hepatocyten en speelt dit mechanisme een rol in de onderbreking van de galzout homeostase, veroorzaakt door een geneesmiddel? (Hoofdstuk 5 en 6; Deel van doelstelling 2)Hoe kan bosetan de galzout dispositie beïnvloeden, zoals weerspiegeld met een prototypisch galzuur, chenodeoxycholzuur (CDCA), in SCHH en welke mechanismen zijn hierbij betrokken? (Hoofdstuk 7, onderdeel van Doelstelling 2)Een eerste studie demonstreerde de uitwisselbaarheid van hepatocyten vóór of na cryopreservatie in het in vitro DIC systeem. Hiervoor hadden we gebruik gemaakt van SCRH, hetgeen een adequate robuustheid bleek te bieden. Tijdens de studie werden SCRH, verkregen uit ofwel vers-geïsoleerde als cryopreserveerde hepatocyten, gebruikt om het cholestatische potentieel van twee gekende cholestatische verbindingen, cyclosporin A en troglitazone te bepalen. Het onderzoek leverde soortgelijke geneesmiddel-geïnduceerde cholestase index waardes (drug-induced cholestasis index; DICI) op, onafhankelijk van de cryopreservatie geschiedenis. Een DICI waarde weerspiegelt de verhouding van ureum dat is geproduceerd onder de omstandigheden waarbij de componenten met een mengsel van galzouten samen geïncubeerd werden en het ureum geproduceerd onder omstandigheden waarin de componenten alleen werden geïncubeerd. Een DICI waarde lager dan 0.80 suggereert dat een component bij een bepaalde concentratie de galzout homeostase in de SCRH kan verstoren. Het was belangrijk dat we tijdens de huidige studie de ureumproductie voor de confluentie van de culturen normaliseerden, aangezien SCRH van cryopreserveerde hepatocyten een lagere confluentie bleken te hebben, in vergelijking met SCRH van vers-geïsoleerde hepatocyten.Om de tweede onderzoeksvraag te beantwoorden, werden 14 (niet)-levertoxische componenten van het EU-EFPIA IMI-project MIP-DILI consortium gebruikt om de prestaties van het in vitro DIC systeem te onderzoeken en aldus een meer uitgebreide validatie van het model uit te voeren. Verscheidene batches van humane hepatocyten in sandwich-cultuur waren gekwalificeerd met betrekking tot hun gevoeligheid voor de analyse van DIC in vitro door cyclosporin A-geïnduceerde veranderingen in de galzout homeostase na te gaan. Om de hoge inter-individuele variabiliteiten tussen donoren te verduidelijken, werden ""Cyclosporin A DICI-positieve"" humane donoren geïntroduceerd om humane donoren uit te sluiten die geen storing in de galzout homeostase veroorzaakten in aanwezigheid van cyclosporin A. De 14 (niet)-levertoxische componenten werden ingedeeld op basis van het veiligheidsmarge (Safety Margin; SM) -concept. Met behulp van de SM, kunnen we het cholestatisch risico van elke component in vivo bepalen. In de huidige studie was het mogelijk om alle 14 (niet)-levertoxische componenten eenduidig te classificeren op hun risico op DIC in vivo, gebaseerd op de SM en in vivo incidentie zoals in de literatuur vermeld stond.De volgende twee studies richtten zich op het mechanistische begrip van de door geneesmiddelen-geïnduceerde verstoringen van de galzout homeostase. Daarom werd de rol van hepatische opname, namelijk het Organische Anion Transporting Polypeptide 1B1 (OATP1B1) in de galzout homeostase dieper bestudeerd. Als hypothese werd gesteld dat domperidone, waarvoor modulatie van OATP1B1-gemedieerd transport in vitro is aangetoond, de opname van galzouten zou kunnen stimuleren en als zodanig de galzout homeostase zou kunnen verstoren. Als eerste, hebben we het modulerende effect van domperidone op OATP1B1-gemedieerde opname van 2 fluorescerende substraten (natriumfluoresceïne en cGamF) onderzocht met behulp van verschillende hepatische in vitro modellen, namelijk OATP1B1-getransfecteerde cellijnen, rat en humane levercellen in suspensie. Daarnaast werd de rol van OATP onderzocht bij de opname van domperidone in hepatocyten van rat en menselijke oorsprong. In het algemeen werd aangetoond dat de stimulerende capaciteit van domperidone substraat- en isoform-afhankelijk was. Daarnaast resulteerde domperidone in een inhibitie van natriumfluoresceine transport in rat hepatocyten. Ten tweede werd het in vitro DIC systeem toegepast om het effect van domperidone op de galzout homeostase te onderzoeken. Opnieuw werd een species-afhankelijk effect waargenomen, waarbij werd aangetoond dat domperidone de galzout homeostase duidelijk in de humane hepatocyten verstoorde, hetgeen niet het geval was in rat hepatocyten. Naast verlaagde DICI waarden door domperidone in humane cellen, was domperidone in staat om de hoeveelheid van de glycine geconjugeerde galzouten te verlagen, terwijl verhogingen werden waargenomen in de hoeveelheid van niet-geconjugeerde galzouten op een concentratieafhankelijke wijze. Daardoor werd er een nieuwe parameter geïntroduceerd, namelijk de bile acid disturbance index (BADI), hetgeen mechanistische informatie bood in welke mate een (cholestatische) component de galzout homeostase kon verstoren in humane cellen. De BADI-waarde is een verhouding van het relatieve verschil in de accumulatie van niet-geconjugeerde galzouten in het cultuur medium en het relatieve verschil in de accumulatie van intracellulaire geconjugeerde galzouten. Zowel domperidone als de positieve controle cyclosporine A waren in staat om BADI op een vergelijkbare manier te verhogen, terwijl afname in DICI waarden voor beide componenten werd waargenomen. Verder werd er geobserveerd dat domperidone de hoeveelheden van endogene galzouten kon verlagen. De studie concludeerde dat domperidone en cyclosporine A in staat waren om de galzout homeostase te wijzigen door mechanismen die nog niet volledig zijn uitgelicht. De modulatie van galzout opname transport in humane hepatocyten zou echter een mogelijk mechanisme kunnen zijn dat deel uitmaakt van DIC. In het algemeen kunnen we stellen dat een betrouwbare meting van endogene en exogeen toegevoegde galzouten in het cultuur medium en cellen een interessant en gevoelig hulpmiddel zijn om veranderingen in de galzout homeostase te onderzoeken. Als conclusie werd er gesteld dat een verstoring in de galzout homeostase, in plaats van een intracellulaire accumulatie van galzouten in het bijzonder, dient als aanvang van DIC.In een laatste studie van het proefschrift, werd er verondersteld dat andere mechanismen dan BSEP-inhibitie mogelijks betrokken zouden zijn bij bosentan-geïnduceerde cholestase. Daarom hebben we de effecten van klinisch relevante concentraties bosentan bestudeerd op de dispositie van endogene galzouten, maar ook werd het effect van bosentan nagegaan wanneer hepatocyten extra gechallenged werden met CDCA. Hierbij hebben we aangetoond dat bosentan in staat was de opname van CDCA te remmen, mogelijks de omzetting van CDCA naar GCDCA te inhiberen en beide sinusoidale en canaliculaire efflux klaringen te beïnvloeden. Bovendien werd inhibitie van galzout synthese door bosentan waargenomen door een verminderde hoeveelheid endogene galzouten in aanwezigheid van bosentan in SCHH. Ten slotte kregen we inzicht in het algemene effect van bosentan op de galzout homeostase in SCHH. In dat opzicht verschaffen deze resultaten een mechanistisch perspectief op de interferentie van bosentan op de galzout dispositie in humane hepatocyten, hetgeen ons zal helpen bij het bekomen van een verbeterd mechanistisch inzicht in bosentan-geïnduceerde cholestase.Samengevat heeft dit onderzoek bijgedragen aan de ontwikkeling en verbetering van nieuwe en momenteel bestaande in vitro methoden voor een betere voorspelling van DIC in vivo. Het in vitro DIC systeem draagt bij tot een betere identificatie van geneesmiddelen of kandidaat-geneesmiddelen die mogelijks DIC in vivo veroorzaken en zodoende ondersteunt het systeem een adequate besluitvorming met betrekking tot het risico van DIC in vivo in te schatten. Daarnaast leverde het inzicht op in de mechanismen die betrokken zijn bij geneesmiddel-geïnduceerde veranderingen in de galzout homeostase door de impact van hepatische opname transport proteïnes in DIC na te gaan. Een verbreking van de galzout homeostase, in plaats van een intracellulaire accumulatie van galzouten is verondersteld aan de basis te liggen van galzout-gemedieerde toxiciteit, hetgeen blijkt uit de gevoelige analyse van galzouten in verschillende compartimenten (medium, cel en gal). Daarom, galzoutmetingen dienen als waardevolle eindpunten om de pathways in de galzout homeostase, die onderbroken worden door een cholestatische verbinding, mechanistisch te bepalen. Hoewel er nog veel fundamentele vragen open blijven, zullen de verkregen resultaten nuttig zijn bij de verdere ontwikkeling van andere, meer geavanceerde in vitro modellen om DIC te voorspellen en benadrukt dit onderzoek het belang om onze kennis te vergroten over de belangrijke pathways die een rol spelen bij DIC." "Target engagement biomerkers voor pijn receptoren" "Jan de Hoon" "Klinische Farmacologie en Farmacotherapie, Anesthesiologie & Algologie" "De klinische ontwikkeling van nieuwe analgetica wordt geconfronteerd met extreme uitdagingen. De meeste geneesmiddelen falen in de ‘proof-of-concept’ fase (fase II) door een gebrek aan efficaciteit en/of veiligheid in de beoogde populatie. Gebrek aan efficaciteit is het meest prominent in ziektes met betrekking tot het centraal zenuwstelsel omdat dierenmodellen hier vaak ontoereikend zijn om ‘target-engagement’ en werkzaamheid te voorspellen in patiënten. Een mogelijke aanpak voor de ontwikkeling van nieuwe analgetica is om reeds in te grijpen in het begin van het pijn mechanisme met name de receptoren en ionenkanalen.Het doel van deze thesis is om modellen te ontwikkelen die zowel inzicht in de fysiopathologie van deze kanalen verstrekken, als ook gebruikt kunnen worden in de vroege ontwikkeling van geneesmiddelen om een eerste indicatie te geven over de ‘target-engagement’ van geneesmiddelen die aangrijpen op deze kanalen.Deze thesis bestaat uit 9 hoofdstukken en 3 delen. In hoofdstuk 1, geven we een algemeen overzicht van de huidige inzichten in neurogene inflammatie en de geassocieerde receptoren, secundaire mediatoren en ziektes. Ook wordt het capsaïcine model besproken als voorbeeld van een ‘target-engagement’ model in praktijk. Hoofdstuk 2 beschrijft de objectieven van deze thesis in meer detail.Deel I bevat alle klinische studies betreffende de TRPV1 receptor. Hoofdstuk 3 beschrijft voor de eerste keer een dysfunctie van TRPV1 in cystinose patiënten, homozygoot voor de 57-kb deletie. Cystinose is een zeldzame ziekte veroorzaakt door een deletie van het cystinosin (CTNS) gen dat ook de niet-coderende regio van het TRPV1 gen affecteert. Omdat TRPV1 geactiveerd wordt door capsaïcine en hoge temperaturen, werd de respons op capsaïcine en hoge temperaturen getest bij deze patiënten. De homozygote patiënten tonen duidelijk een verminderde gevoeligheid voor capsaïcine (zowel voor de vasodilatatie als pijn respons) en een verstoorde detectie van hoge temperaturen, in vergelijking met heterozygote patiënten en gezonde vrijwilligers. In hoofdstuk 4, werd de haalbaarheid van het capsaïcine model met topicale behandelingen onderzocht. In deze studie werd onderzocht of brimonidine, een alpha-adrenerge agonist en de standaard behandeling van rosacea, in staat is om de capsaïcine-geïnduceerde huiddoorbloeding respons (CIDBF) te blokkeren. De rationale achter deze studie was dat neurogene inflammatie en dus de TRPV1-CGRP pathway betrokken is in de pathofysiologie van de huidziekte rosacea, gekarakteriseerd door extreem blozen. Na behandeling met brimonidine 3 uur op voorhand, was de CIDBF matig gereduceerd. Waarschijnlijk omdat brimonidine niet direct interfereert met de TRPV1-CGRP pathway en enkel een indirect effect heeft op de vasodilatatie.Deel II bevat alle klinische studies betreffende de TRPA1 receptor. Om de TRPA1 receptor en toekomstige antagonisten te kunnen onderzoeken, werd een reproduceerbare en robuste ‘target-engagement’ biomerker ontwikkeld zoals beschreven in hoofdstuk 5. Gebaseerd op preklinische literatuur werd cinnamaldehyde (CA) gekozen als selectieve agonist voor dit model. Eerst werd een studie uitgevoerd om de een veilige en robuste dosis van CA te vinden. Van 3 verschillende dosissen werd 10% CA gekozen als de meest geschikte dosis. Met deze dosis werd de reproduceerbaarheid van de CA-geïnduceerde huiddoorbloeding respons getest tussen beide armen en verschillende periodes. Zowel de inter-arm als de inter-periode reproduceerbaarheid werd als voldoende bevonden en berekeningen betreffende de steekproefgrootte toonden aan dat dit model gebruikt kan worden om een 30-50% verschil te detecteren tussen 2 groepen met maximum 15 vrijwilligers. In hoofdstuk 6, probeerden we een beter inzicht te krijgen in de secundaire mediatoren betrokken in de CA-geïnduceerde activatie van TRPA1 en de gerelateerde vasodilatatie. Onverwacht toonden we aan dat de CA-geïnduceerde huiddoorbloeding gereduceerd kan worden door behandeling met de niet-selectieve COX-inhibitoren aspirine en indomethacine en niet met de selectieve COX-2 inhibitor celecoxib or de NK1-receptor antagonist aprepitant. Bijkomend werd aangetoond dat aspirine een sterker inhiberend effect veroorzaakte in vergelijking met indomethacin, dit moet verder onderzocht worden om een passende verklaring te vinden. In dit hoofdstuk toonden we dus aan dat COX-1 afhankelijke PG een belangrijke rol spleen in CA-geïnduceerde huiddoorbloeding. Omdat gedacht wordt dat TRPA1 een belangrijke rol spelt in neurogene inflamaatie en migraine, werd de CA-geïnduceerde huiddoorbloeding vergeleken tussen migraine patiënten, met en zonder aura, en gezonde vrijwilligers in hoofdstuk 7. CA-geïnduceerde huiddoorbloeding was niet verschillend tussen migraine patiënten, met en zonder aura, en gezonde vrijwilligers. Waarschijnlijk omdat TRPA1 perifeer (in de huid van de onderarm) werd geactiveerd en niet in de trigeminale zenuwen waar migraine hoogst waarschijnlijk ontstaat.In het laatste deel, deel III, wordt de PAC1 receptor onderzocht via de ontwikkeling van een selectief en reproduceerbaar ‘target-engagement’ model, het maxadilan model zoals beschreven in hoofdstuk 8. Maxadilan, een peptide afkomstig van de zandvlieg, is een selectieve exogene agonist van de PAC1 receptor. In analogie met het cinnamaldehyde model, werd er ook eerst een veilige en robuuste dosis gezocht. Omdat er geen verschil werd gevonden tussen de 3 geteste dosissen werd de laagste dosis van 0.9ng maxadilan gekozen om verder te gaan. De huiddoorbloeding respons veroorzaakt door een intradermale injectie van 0.9ng maxadilan was uitstekend reproduceerbaar tussen verschillende armen en periodes. Berekeningen betreffende de steekproefgrootte toonden aan dat deze biomarker gebruikt kan worden om een 30-50% verschil te detecteren tussen 2 groepen met maximum 15 vrijwilligers. Een onverwachte piek in huiddoorbloeding werd geobserveerd op 24 uur na injectie en moet verder onderzocht worden. In hoofdstuk 9, worden de resultaten van deze thesis in een bredere context besproken en aanbevelingen voor de toekomstig onderzoek gegeven. In algemeen kunnen we besluiten dat we er in slaagden om 2 nieuwe in vivo ‘target-engagement’ modellen te ontwikkelen voor enerzijds de TRPA1 receptor (het cinnamaldehyde model) en anderzijds de PAC1 receptor (het maxadilan model) en het capsaïcine model voor de TRPV1 receptor verder verfijnd werd. We toonden aan dat deze modellen niet alleen gebruikt kunnen worden om GO/NO GO beslissingen en karakterisatie van patiënten stratificatie te ondersteunen, maar ook om meer inzicht te verwerven in de pathofysiologie van deze receptoren en gerelateerde aandoeningen." "Het bestuderen van de impact van geprogrammeerde kanker cel dood op type I interferon gebaseerde immunotherapie" "Abhishek Garg" "Laboratorium voor Celstress & Immuniteit" "Type I Interferon (IFN) cytokines, zoals IFNα/β, zijn krachtige defensieve factoren geproduceerd door ons immuunsysteem om infecties te stoppen. Vanwege hun brede immunologische werking heeft IFNα/β ook een cruciale rol in steriele inflammatoire ziekten zoals kanker. Type I IFNs hebben diverse antikanker eigenschappen en kunnen tumorregressie veroorzaken. Deze antikanker effecten zijn de rede voor het prioriteren van immuuntherapie bestaande uit, of deels geïnduceerde, IFNα/β. Echter, IFNα/β therapie had teleurstellende resultaten in de kliniek; maar, de verantwoordelijke mechanismes voor dit resultaat, naast de dosisafhankelijke toxiciteit, zijn nog onduidelijk. Wij geloven dat geprogrammeerde celdood van kankercellen een dergelijk mechanisme is. Een interacties tussen Type I IFNs en celdood is aannemelijk, omdat IFNα/β in de klinische setting celdood direct kan induceren of word gecombineerd met andere celdood inductoren. Ondanks de waarschijnlijkheid van interactie, is er weinig kennis over de directe effecten van necroptose & apoptose, de twee meest voorkomende geprogrammeerde kanker celdood mechanismes, op Type I IFNs. Wij vermoeden dat necroptose & apoptose in kankercellen direct de IFNα/β niveaus kan moduleren zodat, afhankelijk van behoud of verval, de potentie van IFNα/β-gedreven immuniteit wordt beïnvloed. In dit project beogen we de impact van apoptotische & necroptotise kankercellen op IFNα/β en de invloed van deze interactie op antikanker immuniteit te begrijpen." "Kunnen voedingsadditieven leverschade veroorzaken? Een mechanistische in vitro modellering studie." "Mathieu Vinken" "Farmaceutische en Farmacologische Wetenschappen" "In de afgelopen jaren stond de veiligheid van voedingsadditieven vaak ter discussie, waaronder een aantal kleurstoffen, zoetstoffen, antiklontermiddelen en glansmiddelen die schadelijke effecten in de lever van proefdieren veroorzaken. Het huidige project zal de mechanismen van deze schadelijke effecten ophelderen door incubatie van deze voedingsadditieven in tridimensionele sferoïdculturen van primaire menselijke hepatocyten en nietparenchymale levercellen gevolgd door “whole transcriptome templated oligo assay with sequencing read-out” en “pathway” analyses. Vervolgens zullen een aantal translationele en functionele analyses uitgevoerd worden om gekende oorzaken en sleutelprocessen van leverschade, in het bijzonder van het steatotisch en cholestatisch type, te detecteren. Daarnaast zal nagegaan worden of transcriptionele effecten aangewend kunnen worden voor het bepalen van veiligheidsmarges voor de dagelijkse inname van voedingsadditieven. Dit project zal bijdragen tot het verifiëren van het levertoxisch potentieel van voedingsadditieven en zal de relevantie van humaan-gebaseerde in vitro methodiek voor risico analyse van chemische stoffen aantonen." "Ontkoppelen van de gunstige en schadelijke effecten van Wnt/beta-catenine activatie in stamcellen voor innovatieve strategieën in kankertherapie en regeneratieve geneeskunde" "Frederic Lluis Vinas" "Stamcel- en Ontwikkelingsbiologie" "De functies van stamcellen worden gereguleerd door een combinatie van groeifactoren en signalen die de gunstige effecten zoals de capaciteit om zichzelf te vernieuwen (self-renewal) of te differentiëren sturen. Afwijkende signalen in de cel kunnen echter leiden tot een kwaadaardige transformatie die resulteert in kanker stamcellen. De Wnt/#-catenine pathway is het schoolvoorbeeld van een multiple effect pathway: onder normale omstandigheden onderhoudt deze de homeostase in stamcellen, maar door een afwijkende activatie kan de pathway ook carcinogenese induceren. Een van de grootste moeilijkheden waar de regeneratieve geneeskunde mee kamt is het behouden van self-renewal en pluripotentie maar tegelijkertijd ook het elimineren van deze tumorigeniciteit van stamcellen. Gebaseerd op onze voorlopige resultaten veronderstellen we dat elke cellulaire functie van de Wnt pathway gereguleerd wordt door een apart lid van de TCF/LEF familie in de nucleus. Onze studies zullen de mogelijkheid bieden om de gunstige en schadelijke effecten van Wnt/beta-catenine pathway activatie te ontkoppelen in stamcellen voor therapeutisch gebruik in regeneratieve geneeskunde, alsook de mogelijkheid om TCFs te gebruiken als nieuwe biomarkers voor embryonale ziekten en als nieuwe targets voor geneesmiddelen in zowel regeneratieve geneeskunde als oncologie ." "Karakterisering van een thermofiele acidogene microbiële gemeenschap die organisch afval afbreekt met productie van de hoogwaardige chemicalie capronzuur door gebruik te maken van een combinatie van “culturomics” en meta-omica" "Claude-Gilles Dussap, Dirk Springael" "Laboratorium Moleculaire Bacteriologie (Rega Instituut), Chemische en Biochemische Reactortechnologie en Veiligheid (CREaS), Bodem- en Waterbeheer" "Voorgestelde schets van het proefschrift: Dit onderzoek beoogt de ontwikkeling van een biologisch model dat de metabole interacties in de biologische anaerobe afval-verteringsreactor C1 van het MELiSSA-systeem verklaart. Dit systeem, gebaseerd op een ecosysteem van meren, richt zich op het recyclen van afval door voornamelijk microbiële reacties, tijdens lange termijn ruimtemissies. Vier hoofdactiviteiten worden uitgevoerd om een gevalideerd biologisch metabool model van de complexe microbiële gemeenschap van de C1-reactor te verkrijgen. Het werk zal beginnen met achtergrondinformatie over de dominante sleutelsteenpopulaties die aanwezig zijn in het systeem onder stabiele prestaties. Ten eerste, de effecten van niet-stationaire omstandigheden (pH of temperatuur purtubaties) op de C1 gemeenschapssamenstelling worden onderzocht met behulp van metagenomics / metaproteomics. Dit geeft aan of andere soorten al dan niet als sleutelsteen moeten worden beschouwd. Ten tweede zullen de meta-omische gegevens van het eerste experiment worden gebruikt om key-stone soorten / pathways / metabolische netwerken in detail te beschrijven door middel van cooccurrence-analyse en key-stone individuele genomen zullen worden gereconstrueerd. Ten derde zullen de substraatspecifieke rol en metabole functies van de sleutelsteensoorten in C1 worden opgehelderd / geverifieerd / gedetailleerd door gebruik te maken van time-lapse 16S rRNA-gen / transcripselsequentiebepaling en DNA / eiwit Stabiele isotooponderzoek na incubatie met individuele afvalverbindingen en structuren. Eindelijk de bijdrage van C1 Keystone-soorten voor specifieke substraatconversie zullen worden onderzocht door hun activiteiten en interacties in kunstmatige co-culturen te bestuderen na hun (op een metagenoom gebaseerde) isolatie van de complexe gemeenschap. Voorlopige beschrijving van de doelstelling (en) van het proefschrift (onderzoeksplan), de methodologie, timing en eventueel eerder uitgevoerd onderzoek met betrekking tot het heden voorstel: Het Micro-Ecologische Life Support System Alternative (MELiSSA) is een concept ontwikkeld door het European Space Agency (ESA), dat voortkwam uit de behoefte aan een regeneratief systeem voor levensonderhoud voor ruimtemissies op lange termijn. Het concept is geïnspireerd op een ecosysteem van meren en is opgevat als een gesloten lussysteem dat bestaat uit 4 biologische compartimenten (C1 en C4) die door gecombineerde activiteit van verschillende organismen organisch afval recyclen tot nieuw voedsel voor het ruimtevaartpersoneel (Hendrickx et al., 2006 ). De robuustheid van de MELiSSA-lus is gebaseerd op het bouwen van robuuste, gestructureerde en voorspellende wiskundige modellen die alleen kunnen worden geïmplementeerd door een grondige kennis van de samenstelling, het gedrag, de metabolismes, kinetiek, beperkingen, remmingen, enz. Van elk subsysteem. Het C1-compartiment is het eerste compartiment in de cyclus. Een thermofiel anaeroob microbieel consortium maakt het vaste afval vloeibaar en produceert ammonium, vluchtige vetzuren (VFA's), CO2 en mineralen. Het algemene doel van dit onderzoek is het verkrijgen van een gevalideerd biologisch metabool model dat de metabolische interacties beschrijft binnen de complexe microbiële gemeenschap van het MELiSSA-compartiment voor afvalafbraak C1. Het onderzoek zal beginnen met de beschikbare achtergrondinformatie van het gastlaboratorium waarin een voorlopig microbieel netwerk wordt beschreven dat rapporteert over de potentiële hoofdsteensoorten en functionaliteit (voornamelijk gebaseerd op hoge abundantie) in de C1-reactor bij steady-state prestaties afgeleid van metaomische gegevens verkregen uit meerdere reactoroperaties onder standaardomstandigheden. Meer specifiek, het onderzoek valideert en detailleert (1) dit voorlopig microbieel netwerk, (2) de overeenkomstige metabole routes en (3) de geïdentificeerde belangrijkste soorten / functies / biomarkers van C1. Om deze doelstellingen te bereiken, zullen de volgende activiteiten (als WP's) worden uitgevoerd. In WP1 zullen C1-reactoren in een vergelijkbare modus worden gebruikt om de achtergrondinformatie te verkrijgen, behalve kleine afwijkingen in de samenstelling van de reactortoevoer en daarbij veranderingen in het dieet en afval van astronauten na te bootsen (Poughon et al., 2013). Naast de prestatieparameters van de reactor, zal de C1 microbiële gemeenschapssamenstelling worden gevolgd door metagenomics / metaproteomics. In andere reactorexperimenten zullen voorbijgaande, meer ingrijpende (pH of temperatuur) verstoringen worden geïmplementeerd. Bovendien zal de gemeenschapssamenstelling van een moeder-C1-reactor die gericht is op het produceren van Cl-reactorinoculum worden bewaakt om de gemeenschapsstabiliteit op lange termijn te detailleren. Deze experimenten zullen ons informeren over de dynamiek en veerkracht van de C1-gemeenschap bij kleine en grote verstoringen. Er zal worden onderzocht of de sleutelsteensoorten en -functionaliteiten blijven / verschijnen na verstoringen en of andere soorten als sleutelsteen moeten worden beschouwd. Bovendien zal extra en nodig voldoende sequentie-informatie worden verzameld voor gedetailleerde route en microbiële / metabole netwerkanalyse in WP2. In WP2 zal de meta-omische informatie verkregen in WP1 en de achtergrond-meta-omische informatie worden gebruikt om (1) sleutelstonespecies verder te identificeren en te beschrijven, (2) om key-stone individuele genomen te reconstrueren met behulp van geschikte metagenomische binaire benaderingen ( Kang et al., 2015) en (3) om keystone-paden / metabole netwerken in de C1-gemeenschap te detailleren. Vergelijkende en longitudinale meta-omic cooccurrence-analyse zal worden uitgevoerd om andere key-stone-soorten aan te geven naast de overvloedige soorten, d.w.z. niet-dominante soorten die naast de dominante soort bestaan (Faust et al., 2012). Evenzo zal gelijktijdig optreden van functionaliteit worden geanalyseerd. Sleutel tot het succes van co-occurrence-analyse is de beschikbaarheid van sequentie-informatie over voldoende monsters / replicaten en de toepassing van goedgekozen verstoringen / condities (zoals uitgevoerd in WP1). De annotatie-analyse van de afzonderlijke key-stone soortengenomen en de mapping van de meta-proteomen daarop zullen de mogelijke functies / activiteiten / interacties van de belangrijkste soorten / routes in de C1-reactor beschrijven en mogelijke microbiële netwerken en zelfs extra sleutel afleiden -steensoort gebaseerd op complementatie van wegen (Faust en Raes, 2012; Roume et al., 2015). WP3 zal worden gebruikt om de substraatspecifieke rol en metabole functies van de sleutelsoorten in C1 verder toe te lichten / te verifiëren / te preciseren. In een eerste taak, in kleinschalige batchexperimenten, wordt de C1-gemeenschap gevoed met individuele substraten die aanwezig zijn in de standaard aanvoer en time-lapse. 16S rRNA-gen / transcriptsequencing zal die belangrijke stenen soorten opsporen die zich vermenigvuldigen, wat wijst op hun rol in het gebruik van bepaalde substraten. Geteste substraten zijn componenten van de standaardvoeding zoals uitwerpselen, salade, toiletpapier en chemische basisstructuren zoals cellulose, glucose, individuele VFA's, eiwitten, peptiden, enz. Bij een tweede taak worden de laatstgenoemde verbindingen gevoed als 13C-gelabelde varianten en time-lapse DNA / eiwit Stabiele isotopentetentie (DNA / eiwit-SIP) (Jehmlich et al., 2016; Chen en Murrell, 2010) zullen worden gebruikt om die soorten en routes (en het vervolg) aan te geven die de respectieve substraten actief omzetten. Tegelijkertijd worden gemeenschapssteekproeven onderworpen aan een metabolomische analyse om de aanwezigheid / activiteit van metabole routes voor de verschillende substraten aan te geven (Zimmermann et al., 2015; Bouvin et al., 2015). De SIP- en metaboloominformatie van het DNA / eiwit zal worden gekoppeld om substraatspecifieke metabole netwerken in C1 af te leiden. Aangezien redundantie in functie wordt verwacht, d.w.z. verschillende soorten kunnen betrokken zijn bij de conversie van dezelfde structuur, zal de respectievelijke bijdrage van een of andere sleutelsteensoort aan substraatomzetting onbekend zijn. Een eerste indicatie wordt gegeven door de relatieve abundantie van de respectieve soort in de 13CDNA- en 13C-eiwitfractie, mogelijk met een bevestiging van intermediaire metabolieten uit metaboloomanalyse en hun groeisnelheden zoals gevolgd door gerichte qPCR. Er zal bewijs worden verkregen in WP4 door substraatomzetting en groeisnelheden van de sleutelsteensoorten afzonderlijk en binnen gereconstrueerde kunstmatige gemeenschappen te onderzoeken. Hiertoe worden sleutelsteensoorten geïsoleerd gebruikmakend van een innovatieve metagenomics-gebaseerde isolatiebenadering, d.w.z. van de gereconstrueerde genomen en potentiële metabole activiteiten (zie WP2), worden media die selectief de belangrijkste steensoort groeien gedefinieerd (Gutleben et al., 2017). Dit lijkt haalbaar omdat de meeste van de dominante keystone-soorten Clostridia zijn die eerder werden gekweekt (Kersters et al., 1994). Als alternatief zullen we soortgelijke (genoom gebaseerde) organismen uit kweekcollecties gebruiken. Samen met informatie van WP2 en WP3 zal deze informatie leiden tot een interactief metabolisch metabolisme van de C1-gemeenschap."