Titel Promotor Affiliaties "Korte inhoud" "Towards Story Understanding and Search - Web Mining Methods and Tools for Exploration, Search and Discovery (Web mining methoden en applicaties voor exploratie, zoeken en ontdekking voor het verstaan van en zoeken in verhaallijnen)" "Bettina Berendt" "Afdeling Informatica" "In de afgelopen jaren is het Internet één van de belangrijkste bronnen voor nieuws geworden. Het gebruik van verschillende online nieuwsdiensten is voor veel mensen dan ook het voornaamste medium geworden om op de hoogte te blijven van de actualiteit. Dergelijke diensten ondersteunen Internetgebruikers in interactie met verhalen.    In dit doctoraat zien we een verhaal als een verzameling van documenten met een tijdsaanduiding die gerelateerde onderwerpen beschrijven, en handelen over personen of verslaggeven over gebeurtenissen en andere onderwerpen. Onze bijzondere interesse ligt in het onderzoeken van de tijdsdimensie van deze verhalen in het algemeen, en story tracking, i.e.het volgen van de verhaallijn doorheen de tijd, in het bijzonder. Het doel van verschillende onderzoeksdomeinen met interesse in story trackingis om de ontwikkelingen van verhalen, i.e. nieuwe en relevante informatie, te identificeren en te beklemtonen. In dit werk beperken we ons tot nieuwscollecties en onderzoeken de effectiviteit en bruikbaarheid van temporal text mining (TTM) story tracking methodes.Doorheen het doctoraat onderzoeken we vier domeinen gerelateerd aan verhalen: (a) verhalen en zoekmachines; (b) story tracking methodes en tools; (c) raamwerken voor de evaluatie van story tracking, en (d) verhalen en bronnen. We formaliseren deze 4 thematische domeinen in de volgende, meer concrete onderzoeksvragen, die we in deze thesis beantwoorden: (Q1) Hoe worden zoekmachines beïnvloed door de ontwikkelingen in verhalen? (Q2) Stelt de semi-automatische methode voor story tracking die we ontwikkelden de gebruiker in staat om de verhalen te begrijpen en er in te navigeren? (Q3) Kunnen de graafgebaseerde patronen die geëxtraheerd worden door onsalgoritme, gebruikt worden voor story tracking? (Q4) Hoe kunnen verschillende piekmomenten in tekstpatronen gebruikt worden voor het ontdekken van veranderingen in verzamelingen van documenten? (Q5) Hoe kunnen de verschillen tussen een verhaal afkomstig van verschillende bronnen gemetenworden? We starten met het verkennen hoe verschillende gebruikers van zoekmachines hun gedrag veranderen wanneer nieuwe ontwikkelingen zich voordoen in een verhaal. Hiervoor onderzoeken we een query log van een toonaangevende zoekmachine over de periode van een jaar, en beschrijven de veranderingen in het gedrag van de gebruikers bij het optreden van nieuwegebeurtenissen. Vervolgens verkennen we story tracking methodes en tools als een middel om te voorzien in deze veranderingen in het gedrag van gebruikers. We stellen een nieuwe, graafgebaseerde story tracking methode voor en ontwikkelen een tool om dit te ondersteunen. Bovendien onderzoeken we de effectiviteit van story tracking methodes en definiëreneen nieuw raamwerk voor een automatische en gebruikersgeoriënteerde evaluatie. Hoewel er verschillende TTM methodes ontwikkeld zijn, is er een gebrek aan een gemeenschappelijke evaluatieprocedure. We stellen een evaluatieraamwerk voor om te meten hoe verschillende TTM methodes nieuwe ontwikkelingen ontdekken. Afgezien van de automatische evaluatie zijn we geïnteresseerd in hoe gebruikers interageren met patronen en leren over de ontwikkelingen in het verhaal dat ze volgen. Hiertoe voorzien we een verzameling metrieken en procedures voor de evaluatie van gebruikersinterfaces in de context van story tracking. Om onze tool te testen, voerden we een gebruikersstudie uit met vier interfaces in de context van story tracking.Tenslotte kijken we naar de bron van verhalen, onderzoeken we wat de mogelijke verschillen zijn in de verslaggeving vannieuwsfeiten tussen verschillende nieuwsbronnen, en hoe we deze kunnen meten.De resultaten van onze analyse tonen aan dat onze methode vergelijkbaar is met andere TTM methodes, en het tegemoet komt aan de vereisten voor story tracking. We tonen ook aan dat, door gebruik te maken vande patroonstructuur en zinsanalyse, TTM methodes gebruikt kunnen wordenvoor het ontdekken van ontwikkelingen in het nieuwsdomein. De resultaten van het gebruikersonderzoek tonen aan dat gebruikers een voorkeur hebben voor onze tool in vergelijking met de andere tools die gebruikt werden in het gebruikersonderzoek. Ze wijzen er ook op dat de tool voldoet aan een aantal vereisten die we ontdekten in de analyse van de query logs." "Invloed van verschillende procesgeïnduceerde (micro)structuren op de in vitro zetmeelverteerbaarheid van gewone bonen: Een kinetische benadering" "Tara Grauwet" "Afdeling: Centrum voor Levensmiddelen- en Microbiële Technologie" "Iedereen heeft er al van gehoord: de voedselketen en zijn producten moet dringend nog meer focus leggen op duurzame levensmiddelen die een positief effect hebben op de menselijke gezondheid, maar daarnaast ook tegemoetkomen aan een verminderde belasting op het milieu. In dit kader wordt een verhoogde consumptie van plantaardige levensmiddelen (bvb. granen, fruit, peulvruchten, noten, groenten) sterk aangeraden. Als voedingswetenschappers en de bijhorende industrieën zich meer gaan toeleggen op de ontwikkeling van veilig en nutritioneel hoogstaande levensmiddelen van duurzame bronnen, kunnen we dagelijks een stapje vooruit zetten. Peulvruchten, meer bepaald de droge zaden van deze familie, vormen een bijzonder interessante voedingsgroep in dit verhaal. Deze droge peulvruchtzaden bevatten een groot scala aan verschillende macro- en micro‑nutriënten die allen op verschillende structurele niveaus van nature in de zaden zijn ingebouwd. Droge peulvruchtzaden worden op zich niet geconsumeerd, maar worden eerst behandeld voor consumptie. Deze procesvoeringsstappen hebben een invloed op de eetbaarheid van de zaden (bvb. hardheid/kauwbaarheid) , maar ook op hun structurele organisatie en vertering. Fundamentele studies die de mogelijkheid van procesvoering bestuderen om structuur op verschillende schaalniveaus (macrostructuur, microstructuur, moleculaire structuur) te modificeren, zijn echter beperkt.Wij postuleren in dit doctoraatsonderzoek dat procesvoering kan gebruikt worden als een strategie die specifieke (micro)structuren van de gewone boon kan genereren en dat deze specifieke structuren kunnen resulteren in verschillende in vitro verteringseigenschappen van zetmeel. De gewone boon werd in dit werk gekozen als representatieve matrix en dit zowel op het niveau van belang van productie als consumptie in de droge peulvruchtenfamilie. Als eerste uitdaging werden een scala van procesvoeringsvariabelen uitgevoerd en werd het effect hiervan op de macro- en micro-structurele eigenschappen van de gewone boon bestudeerd. Meer bepaald werd telkens het effect van een welbepaalde combinatie van variabelen geëvalueerd in functie van de procestijd (kinetica). Als tweede uitdaging werd vervolgens de consequentie van een reeks duidelijk verschillende structuren bestudeerd inzake in vitro zetmeel digestie. Specifieke aandacht werd besteed aan de digestie in de dunne darm, waarbij ook het effect van digestietijd (kinetica) werd geobserveerd gebruik makende van zowel kwantitatieve als kwalitatieve technieken.Conventionele (95°C, 0.1 MPa, f(t)) en alternatieve (25°C, 600 MPa, f(t) or 95°C, 600 MPa, f(t)) procesvoering werd gebruikt. Enkel wanneer hoge temperaturen werden gebruikt, konden gewone bonen van eetbare hardheid worden bekomen. Wanneer gewone boon werd behandeld bij hoge druk (600 MPa) bij 25°C, kon er geen duidelijke hardheidsreductie worden waargenomen, zelfs bij lange procestijd. Gelijkaardige hardheidsprofielen werden bekomen voor de twee bestudeerde procestechnieken bij verhoogde temperatuur (95°C), ongeacht of deze behandeling nu bij hoge druk of bij atmosfeerdruk werd uitgevoerd. Wanneer voor beide behandelingen bij verhoogde temperatuur eenzelfde mechanische desintegratiestap in rekening werd genomen, resulteerde dit ook in gelijkaardige microstructuren. Stalen die slechts een korte procestijd ondergingen, werden eerder gekarakteriseerd door celclusters en open cellen als microstructuur. Celwandbreuk kwam wellicht veel voor omdat pectine in de middenlamella van de primaire celwand onder deze condities wellicht nog niet (voldoende) was gesolubiliseerd. Bij het verlengen van de procestijd, werden steeds grotere porties aan individuele cellen in de stalen waargenomen, wanneer de thermisch geïnduceerde pectinesolubilisatie wel voldoende had kunnen optreden. In de consumptieketen van de gewone boon komt steeds een stap van mechanische desintegratie voor. Deze kan onderdeel maken van de keten (bvb. bij productie van ingrediënten en producten) of deze kan onderdeel uitmaken van de verteringsketen: in de mondfase vindt bij consumptie van vaste levensmiddelen een belangrijke vermalingsstap plaats. Om het effect van dergelijke menselijk kauwfase te bestuderen, werd een kauwstudie uitgevoerd met hulp van 20 deelnemers die werden gevraagd thermische behandelde bonen te kauwen en uit te spuwen op het moment van doorslikken bij normale consumptie. Tijdens verschillende sessies werd aan de deelnemers gevraagd om bonen van verschillende hardheden na koken (95°C, 0.1 MPa, f(t)), te kauwen, alhoewel allen eetbaar. Als resultaat bleek dat individuele kauwpatronen geen significante invloed hadden op de partikelgroottedistributies van de bolussen. De hardheid van de stalen na koken hadden wel een duidelijke invloed op de partikelgroottedistributies van de bolussen. Vanuit microstructuurstandpunt bleken individuele gesloten cellen de karakteristieke microstructuur van de bolussen, waarbij het massa‑aandeel van deze karakteristieke microstructuur duidelijk toenam in functie van langere kooktijd en dus de lagere residuele hardheid. Met de toename van massapercentage van de fractie bestaande uit individuele cellen, nam het massapercentage van grotere microstructuren (celclusters) af.Ook na in vitro digestie van de bekomen in vivo bolussen, bleek een individuele gesloten cotyledon cel de meest karakteristieke microstructuur. In deze cel spelen aanwezige zetmeelomgevende barrières (met name celwand en proteinematrix) wellicht een belangrijke rol in de zetmeelvertering. Uit dit werk bleek dat in vitro verteerde heterogene in vivo bolussen en homogene geïsoleerde individuele cotyledon cellen van gekookte gewone boon, verschillende kooktijden in rekening genomen, resulteerden in duidelijk verschillende zetmeelverteringseigenschappen en verteringsgedrag in functie van de tijd (kinetica). Deze verschillende en bijhorende kinetische data werden gekwantificeerd met mathematische modellering gebruik makende van een reparametriseerd logistisch model. Dit logistisch model werd voor de eerste keer gebruikt in het kader van zetmeeldigestie. De gedetecteerde verschillende werden verklaart aan de hand van geobserveerde procesgeïnduceerde verschillen op het niveau van de zetmeelbarrières. Meer bepaald werden langere lagfases bekomen in stalen die slechts gedurende kortere tijd werden behandeld en gekarakteriseerd werden door cellen met lagere graad van celwand permeabiliteit alsook een meer compact proteinenetwerk. Analoog werden hogere reactiesnelheidsconstanten bij stalen die langer behandeld waren, gelinkt aan de hoeveelheid enzyme dat bindt en zetmeel afbreekt per minuut, wat enkel kan gebeuren als het enzyme door en rond de bovenvermelde barrières raakt.In een laatste deel van dit doctoraatsonderzoek werd mechanistisch inzicht in de in vitro zetmeelvertering van individuele, thermisch behandelde (95°C, 0.1 MPa, f(t)) cotyledoncellen bekomen. Hierbij werden digesten onderverdeeld in supernatant en pellet fracties. De geïsoleerde fracties werden onderworpen aan verschillende kwalitatieve en kwantitatieve karakterisaties. Voor het eerst werd aangetoond dat bij vertering van cellulaire structuren van gewone boon cotyledonen de digestie in de cel gebeurd, onafhankelijk van de kooktijd in de range van eetbare hardheden. In deze context werd een driestapsmechanisme voorgesteld: (i) enzyme diffusie doorheen de celwand gevolgd door het overwinnen van eventuele hinder door de cytoplasmatische inhoud (bvb. proteinematrix); (ii) adsorptie van het enzyme op de zetmeelgranule en hydrolyze van zetmeel startende van de periferie van de cel naar het midden van de cel toe; gecombineerd met (iii) diffusie van verteringsproducten van binnen naar buiten de cel. Met behulp van microscopische evaluaties kon ook worden aangetoond dat proteinevertering in parallel verloopt met zetmeelvertering en wellicht verloopt volgens een gelijkaardig mechanisme als hetgeen bovenstaand beschreven wordt voor zetmeelvertering. Ten slotte werden verschillende snelheidsbeperkende stappen voor zetmeelvertering in cotyledoncellen gepostuleerd, afhankelijk van de intensiteit van het toegepaste thermische proces.Samenvattend toont dit doctoraatsonderzoek aan dat er duidelijk potentieel is om in situ de in vitro zetmeelverteringskinetica van gewone boon te sturen met behulp van doelbewuste procesvoering die de structurele eigenschappen van de gewone boon beïnvloeden. In dit werk werd vooral gewerkt met procesvariabelen die momenteel gebruikt worden op huishoudelijk of industrieel vlak. Dit kan de toepasbaarheid van dit onderzoek enkel ten goede komen." "Isolatie, productie, semi-kristallijne aggregatie en potentiële farmaceutische toepassing van amylose" "Jan Delcour" "Afdeling: Centrum voor Levensmiddelen- en Microbiële Technologie, Polymeerchemie en -materialen" "Amylose (AM) is een quasi lineair glucosepolymeer. Samen met amylopectine (AP) vormt het de basis van granulair zetmeel. Het gehalte AM in natieve zetmelen varieert van 20 tot 35%. Het beïnvloedt sterk de functionaliteit van zetmeel in waterige systemen. In dispersies van volledig verstijfseld zetmeel speelt AM-kristallisatie een belangrijke rol in het verstijfselingsproces. In veel levensmiddelenbereidingen begint de AM-netwerkvorming onmiddellijk na de zetmeelverstijfseling. Door aggregatie van AM worden aaneengesloten cilindrische objecten en uiteindelijk fractale structuren gevormd. Deze structurele overgangen worden gebruikt om textuur te geven aan verschillende voedingsproducten. AM-kristallisatie wordt ook gebruikt om type III enzym-weerstandig zetmeel (RS) te produceren, een soort zetmeel dat niet volledig wordt verteerd (en dus gedeeltelijk bestand is tegen vertering), in de dikke darm gefermenteerd kan worden en dat verschillende potentiële gezondheidsvoordelen heeft.AM kristallisatie hangt af van factoren zoals de gemiddelde polymerisatiegraad (DP), de concentratie ervan in de suspensie, de temperatuur en de tijd. De concentratie ervan bepaalt het type van kristalstructuur dat het aanneemt. Terwijl in verdunde waterige systemen [typisch 10,0% (w/v)]. Deze kristalstructuren zijn bestand tegen spijsvertering door pancreas α-amylase. Ze kunnen echter gefermenteerd worden door de micro-organismen in de menselijke dikke darm.Ondanks de relevantie van AM als een standalone polymeer, zijn de onderliggende mechanismen van de aggregatie ervan hoofdzakelijk onderzocht in zetmeelsystemen, die van nature ook AP bevatten. Tegen deze achtergrond was het doel van dit proefschrift om meer inzicht te verwerven in de productie of isolatie van AM en de fysico-chemische eigenschappen ervan, om zo een basis te bieden voor het gebruiken van AM-kristalliniteit bij de ontwikkeling van mogelijke toepassingen binnen en buiten de voedingsindustrie.Een methode voor het produceren van zuivere AM op laboratoriumschaal was nodig om de mechanismen van AM aggregatie te bestuderen. Daarom richt het eerste deel van dit proefschrift zich op het produceren of isoleren van AM. Drie meest toegepaste in vitro benaderingen werden overwogen voor het verkrijgen van AM: enzymatische synthese, AM-uitloging en AM-complexatie na zetmeeldispersie. De productie of isolatie van AM is echter niet eenvoudig. De eigenschappen (d.w.z. zuiverheid, gemiddelde DP en polydispersiteit) van geïsoleerde AM worden beïnvloed door de experimentele condities bij elke methodologie. Uitloging met behulp van water maakt het mogelijk om op grote schaal AM te isoleren en omvat het verhitten van een zetmeelsuspensie boven de verstijfselings-temperatuur van zetmeel. Verschillende factoren beïnvloeden uitloging van AM, inclusief de uitlogingstemperatuur (LT) en zetmeelconcentratie. Een respons-oppervlak analyse met een face centered central composite design werd geïmplementeerd om het effect van zetmeelconcentratie [3,0-7,0%  (w/v) van maïs (Zea mays L.)] en LT (70-90 ˚C) op waterige uitloging van AM te bestuderen, als een manier om de condities te optimaliseren voor het verkrijgen van de hoogste opbrengst van lange keten AM [gemiddelde DP (DPn) variërend van 860 tot 930] en de hoogste zuiverheid. Tweede-orde empirische modellen werden aangepast via de kleinst kwadratische benadering. Verwaarloosbare termen werden verwijderd met behulp van terugmodelreductie. Verwaarloosbare lack of fit terms werden verkregen voor de responsen van totaal uitgeloogd koolhydraat en DPn. De optimalisatie werd vervolledigd met een wenselijkheidstest waarbij gebruik werd gemaakt van de zuiverheid van de extracten. Als optimaliseringsdoelstellingen werden de maximale uitlogingsopbrengsten DPn ≈ 900 en zuiverheid> 95 % vastgesteld. Er werden zogenaamde contour plots en voorspellingsprofilers verkregen die door anderen gebruikt kunnen worden voor op maat gemaakte productie van uitlogingsproducten. LT had het meest significante effect vermits opbrengsten en DPn verhoogden met temperatuur ten koste van de zuiverheid. Zuiverheid kwam sterk in het gedrang bij behandelingen bij temperaturen hoger dan 85 ˚C. Dit werd weerspiegeld in de hoge DPn waarden (> 1.500) die op de aanwezigheid van AP materiaal duidden. Het gebruik van 3,0% (w/v) maïszetmeelsuspensie bij een LT van 81 °C resulteerde in de grootste opbrengst (15,0%, zetmeelbasis) van hoge DPn AM-ketens (DPn ≈ 900), met minder dan 3,3% van niet-AM materiaal.Het effect van zetmeelkristalliniteit op de waterige uitloging van AM werd ook bestudeerd. De stabiliteit van zetmeelkristallen werd veranderd via tempering (annealing). Uitloging werd onderzocht in een temperatuurbereik van 60-90 °C. De opbrengst van uitlogingsproduct (leachate), gemiddelde DP en zuiverheid waren gerelateerd aan de smeltingsgraad van de zetmeelkristallen bij de LT zoals bepaald via differentiële scanning calorimetrie (DSC). Tempering verhoogde de AP kristalstabiliteit en hierdoor ook de resterende kristalliniteit bij een gegeven LT. Verwaarloosbare AM-uitloging vond plaats bij temperaturen lager dan deze van de tempering-afhankelijke begintemperatuur van smelten. Uitloging kon dus profiteren van gedeeltelijk smelten. Soortgelijke AM-uitlogingsproducten werden verkregen wanneer de mate van zetmeelsmelting lager was dan 80 %. Verlies van meer dan 95 % van de smeltingsentalpie resulteerde in een hogere gemiddelde DP van de uitlogingsproducten ten koste van de zuiverheid. Aangezien de kristalliniteit van getemperd zetmeel bij een gegeven LT hoger was dan die van natief zetmeel, was de zuiverheid van uitlogingsproducten verkregen uit dergelijke zetmelen hoger. Ondanks het feit dat er geen residuele AP-kristallen meer aanwezig waren bij 90 °C, vertoonde getemperd zetmeel onderworpen aan uitloging bij deze temperatuur nog steeds AM-extracten in hogere opbrengsten en met een hogere zuiverheid dan natief zetmeel. De meer efficiënte uitloging in dit geval kan het gevolg zijn van tempering-geïnduceerde versterkte AP-AP interacties en AM-ontknoping van AP.Het tweede deel van dit werk was gericht op de semi-kristallijne aggregatie van AM. Terwijl eerdere studies de rol van de gemiddelde AM DP op de aggregatie ervan in verdunde waterige systemen hebben toegelicht, zijn er geen studies uitgewerkt over de kristallisatie van AM in geconcentreerde systemen. Hier werden AM-stalen met verschillende gewichtsgemiddelde DP’s (DPw) geproduceerd en onderworpen aan een verwarming-koeling-verwarmingsproces. Aangezien AM kristallen alleen smelten bij temperaturen hoger dan 100 °C, werden hogedruktoestellen gebruikt om de gehydrateerde stalen te analyseren. Waterige AM dispersies [25,0% (w/v)] met een hoge (DPw = 830), gemiddelde (DPw = 340) en lage (DPw = 60) DP werden eerst verwarmd tot 180 °C om volledig opgeloste waterige oplossingen van AM te produceren. Tijdens daaropvolgende afkoeling tot omgevingstemperatuur gevolgd door heropwarming tot 180 °C, werden hun thermische en structurele veranderingen door middel van DSC en röntgendiffractie bij kleine (SAXS) en brede (WAXD) hoek onderzocht. Tijdens afkoelen werden sferulitische kristalaggregaten gevormd waarvan de afmetingen daalden in de volgorde gemiddelde DP> lage DP> hoge DP AM. De kristallisatie was ook afhankelijk van de AM DP. Gemiddelde DP AM kristallen werden gevormd bij hoge temperaturen en de exotherme overgang ervan vertoonde een piek bij 74 ˚C. Lage en hoge DP AM kristallen werden bij temperaturen lager dan 60 °C gevormd met pieken van respectievelijk 37 en 42 °C. Een tweede (kleine) fractie was zichtbaar bij lage DP AM en verscheen dicht bij de geobserveerde hogetemperatuurtransitie voor midden DP. Gedurende de daaropvolgende verwarming waren de gemiddelde DP AM kristallen het meeste stabiel en hun smeltingssignaal bereikte een piek bij 156 °C. Lage DP AM kristallen smeltten in twee brede temperatuurbereiken met pieken bij 104 °C (grote fractie) en 150 °C (kleine fractie). Kristallen van hoge DP AM smolten in een gelijkaardig bereik als geobserveerd voor laag DP AM.Tijd-temperatuur geresolveerde SAXS- en WAXD-metingen werden voor het eerst toegepast om de nanostructurele overgangen te onthullen van AM tijdens de vorming en het verdwijnen van semikristallijne sferulieten van lage en gemiddelde DP AM. WAXD metingen toonden naast amorf materiaal de vorming van B-type AM polymorfen aan, ongeacht de temperatuur. Veranderingen in de kristalliniteitsindex verschenen in de temperatuurbereiken waar DSC exo of endothermisch overgangen toonde. Inter-kristalliet-interferentie werd gevonden in SAXS voor lage DP AM, terwijl dit niet het geval was voor gemiddelde DP AM. Gemiddelde DP AM sferulieten werden geclassificeerd als open (geen interferentie), die van lage DP AM als compact (met interferentie). Open sferulieten hadden een lagere interne kristalliniteit (minder dan 20 %) dan de compacte (tot 80 %), maar konden de ruimte volledig innemen bij afkoeling. Open sferulieten van gemiddelde DP AM starten vanaf de kristallisatie van AM in een homogene vloeibare fase. Dit vormt AM-depletiezones rond de kristallen bij een hoge kristallisatiesnelheid. Bij lagere temperatuur groeien sferulieten en worden nieuwe sferulieten gecreëerd aan lagere snelheid. Hier kan de vloeibare fase de tred volgen en tegelijkertijd homogeniseren. In het geval van sferulieten afkomstig van lage DP AM, worden bij hoge temperaturen eerst open sferulieten gevormd, vergelijkbaar met sferulieten van gemiddelde DP AM. Bij verdere afkoeling scheidt het systeem zich in AM-rijke en -arme vloeibare fasen. Sferulieten migreren naar de AM-rijke regio en verdere AM kristallisatie treedt snel op, wat de aggregaten omvormt tot compacte sferulieten. Voor hoge DP AM werd gesuggereerd dat verstrikking van de ketens de vorming van grote en geordende aggregaten bij hoge temperaturen afremt. In plaats daarvan wordt vloeistof-vloeistoffasenscheiding begunstigd, en de kristallisatie van AM in kleine, ongeordende sferulieten vindt plaats in de AM-rijke zone.In een derde en laatste deel werd de kristalliniteit van AM gebruikt in de ontwikkeling van een mogelijke farmaceutische toepassing. Type III RS uit onttakte cassave (Manihot esculenta Crantz) zetmeel werd geproduceerd door AM kristallisatie te promoten in een hydrothermale behandeling. Een thermostabiele kristalfractie werd gevormd. Type III RS kristalsmelting werd inderdaad alleen waargenomen bij temperaturen hoger dan 120 °C. RS gehaltes gemeten tijdens in vitro vertering stegen van 36,6 (in het startmateriaal) tot 95,1% (in het finale type III RS product). RS-gehaltes waren positief gecorreleerd met de mate van kristalliniteit. Type III RS was zeer in vitro fermenteerbaar door menselijke fecale micro-organismen en resulteerde in een significante productie van korte-keten vetzuren. Acetaatgehaltes waren veel hoger dan die van propionaat en butyraat in vergelijking met hun gehaltes geobserveerd bij een fecale blanco. Een granulaat van type III RS [60-70 % (w/w)] en ethylcellulose [40-30 % (w/w)] werd gebruikt om tabletten van 5-aminosalicylzuur (5-ASA) te coaten door gebruik van een compressie-coating aanpak. Het coaten beschermde 5-ASA tijdens zijn transit door een maagdarmkanaal model. Er werd geen vrijgave waargenomen in gastrisch medium en verwaarloosbare vrijgave werd waargenomen na 2 uur in darmmedium dat pancreas amylase bevatte. Het gebruik van dit materiaal kan interessanter zijn dan dat van polymeren zoals cellulose doordat een (mogelijk) therapeutisch effect uitgeoefend wordt door verhoogde korte-keten vetzuurgehaltes als gevolg van fermentatie. Deze studie leverde aldus ook de basis voor toepassingen van AM-kristallen in de farmaceutische industrie." "Optimalisatie van een faagtherapie tegen bacteriële pathogenen in kool en prei" "Anneleen Volckaert" "Kenniseenheid openlucht groenteteelt, KULeuven, EIGEN VERMOGEN VH INSTITUUT VOOR LANDBOUW- EN VISSERIJONDERZOEK, Proefstation voor Groenteteelt, Inagro, provinciaal extern verzelfstandigd agentschap in privaatrechtelijke vorm" "TERUGBLIK Werkpakket 1: Optimale toepassing van fagen in de teelt van kool en prei Taak 1: Kritieke bodembesmetting voor infectie van kool door Xcc en van prei door Pspo Xcc en Pspo zijn zaadovergaande bacteriën. Daarom wordt een vaststelling in een gewas dikwijls toegewezen aan besmetting van zaden die dan op de plantenkwekerijen wordt overgezet op de jonge planten. Zaadbedrijven doen nochtans inspanningen om gezonde zaden te leveren. Maar de routes voor zaadbesmetting zijn nog niet volledig gekend en een micro-besmetting kan in de gunstige omstandigheden macroschade aanbrengen. De genetische structuur van de Xcc en Pspo stammen van de Vlaamse velden vertoont niet de variatie die je zou verwachten als de bacteriën gangbaar door  besmette zaden worden geïntroduceerd. Hieruit volgt dat in Vlaanderen bodembesmetting de belangrijkste (bron) zou zijn voor infectie. Er is aangetoond dat Xcc koolplanten langs de wortels kan infecteren. De bacterie koloniseert dan het vasculair systeem. Voor jonge bloemkoolplanten was een relatief hoge hoeveelheid bacteriën aan de wortels (drench) en wortelbeschadiging (knippen) nodig voor symptomatische infectie. Als bloemkoolplantjes cv. Giewont zonder mechanische wortelbeschadiging in een besmette grond van 104, 106 of 108 Xcc/g werden opgekweekt, dan werden na 12 weken geen symptomen van zwartnervigheid vastgesteld in de bladeren. De analyse van het vaatweefsel van een stengelsegment net boven de wortels door selectieve isolatie en TaqMan PCR toonde Xcc ook niet aan als latente infectie in de individuele koolplanten. Blijkbaar was de infectie daar niet geïnstalleerd. In wortelmonsters werd Xcc door TaqMan PCR wel sporadisch aangetoond in het object 106 Xcc/g (1/18 planten) en in het object 108 Xcc/g (7/18 planten). Dat de infectie niet in het bovengronds vasculair systeem van de koolplanten is vastgesteld heeft mogelijks te maken met de bijwijlen hoge temperatuur (tegen 40°C) in de serrecompartimenten. Provisoir kan worden aangenomen dat vasculaire infectie van Xcc in koolplanten vanuit een besmette bodem mogelijk is maar onvoorspelbaar is en traag verloopt. Omdat beschadiging van de wortels de infectie bevordert zijn op koolpercelen plaatsen waar die zich kunnen voordoen, zoals aan spuitsporen. Het is evenwel weinig waarschijnlijk dat de gebruikte niveaus van bodembesmetting op koolpercelen zouden optreden. Het is aannemelijk dat bodembesmetting in het ontstaan van infecties vooral Xcc met opspattend water op koolbladeren doet afzetten. Alternatief kan Xcc vanuit de wortels doorheen het vasculair systeem in gutatiedruppels aan de bladrand worden gebracht waarna infectie daar aanvangt. In een gelijkaardig experiment werden preiplanten cv. Harston niet in de wortels geïnfecteerd in besmette preigrond. De bacterie is geen vasculair pathogeen. Ze overleefde wel aan de preiwortels. Als bijgevolg prei in een besmette bodem wordt geplant dan moet de bacterie eerst op de bladeren worden afgezet, bv. via opspattend water, om infectie te veroorzaken. Bodembesmetting kan dus van belang zijn tijdens de opkweek van jonge planten. Experimenteel werd prei gezaaid in besmette grond met 106 en 108 Pspo/g en werd de bacterie van respectievelijk 19 en 81 van 100 kiemplanten met TaqMan PCR gedetecteerd. De bacterie had zich epifytisch op de zaailingen geïnstalleerd, net zoals die dat doet op zaailingen vanuit besmette zaden. Dit impliceert dat fagen de preibladeren reeds op het zaaibed moeten beschermen. Na uitlichten van de planten op het zaaiperceel wordt blad immers goed ingekort. Deze beschadiging versmeert de bacterie en werkt infectie in de hand. Faagbehandelingen op het zaaibed zijn bijgevolg aangewezen om het primair inoculum van Pspo klein mogelijk te houden. Aangezien besmetting van Pspo in zaadloten niet denkbeeldig is, kunnen fagen vanaf de kieming bescherming bieden.De besmetting van het plantsubstraat werd uitgevoerd met bacteriezieke kool- of preibladeren gehomogeniseerd met water in een blender. De bacterie bevond zich in virulente toestand. In de uitgevoerde simulaties werden de besmettingen onecht hoog aangemaakt zodat binnen een relatief kort tijdskader de uitwerking van de test kon worden gemeten. In gepubliceerd onderzoek is de natuurlijke besmetting op kool- en preipercelen zelden hoger dan 104 bacterie/gram grond. Het aandeel van bodembesmetting in ontstaan van bacterieziekte in kool en prei wordt sterk bepaald door de onderzoeksmethodiek (planktonische cellen of zieke plantenresten, uitkweken van de bacterie op semiselectieve voedingsmedia of detectie in PCR). Gebruik van een GFP-gelabelde Xcc en Pspo stam kan meer inzicht brengen in het aandeel van bodembesmetting in de infecties van koolplanten. Taak 2: Kwantitatieve PCR voor faag tracking Een detectietool werd ontwikkeld en uitgewerkt om de gebruikte fagen op te sporen in de bodem en in/op planten. De real-time PCRs op het SYBR Green principe werden ontworpen uit de genomische sequenties van de KIL-fagen van Pspo en de SoPhi-fagen (later hernoemd als FoX-fagen) van Xcc. De assays werden geoptimaliseerd op gevoeligheid en specificiteit. De specifieke detectie van de KIL-fagen kan worden gedaan met een 101 bp sequentie in een gen dat codeert voor een putatieve serine protease. De gevoeligheid van de assay in faagbuffer (Level Of Detection) is 5 kopijen in de PCR reactie bij een gemiddelde Ct-waarde van 36,3. De test toont een efficiëntie van 94% over 8 logs faag DNA. De vijf KIL-fagen worden gedetecteerd (100% inclusiviteit). Zowel in silico analyse als in labtesten detecteerde de assay geen andere fagen (100% exclusiviteit). Het was niet mogelijk om alle FoX-fagen in één assay te detecteren. In een bio-informatica pipeline met aangepast script werden 3 primersets uitgewerkt voor FoX1/FoX2 en 4 primersets voor FoX4 met amplicons van 100 bp tot 102 bp. De gevoeligheid van de meest geschikte assay in faagbuffer (Level Of Detection) is 85 kopijen in de PCR reactie bij gemiddelde Ct-waarde van 34. Detectie van FoX-fagen is minder gevoelig dan van KIL-fagen. De test toont een efficiëntie van 94% over 9 logs faag DNA. De FoX2 primers bleken naderhand ook de FoX3- en FoX5-fagen te detecteren.Voor toepassing van de qPCRs in plant- en grondmonsters werd verdere validatie uitgevoerd met gBlocks, synthetische DNA moleculen van de doelsequenties van de KIL en FoX fagen (304 bp). Die werden toegevoegd aan extract van respectievelijk koolwortels en preiblad. Detectie werd verkregen tot 0.05 fg gBlock in de PCR reactie, wat overeenkomt met 152 kopijen in de PCR reactie. Toepassing van de qPCR assays in wortel- of bladextract heeft een nadelig effect op de LOD. Daarom is de isolatie van DNA via een extractiekit wenselijk. Monsters van 250 mg koolwortels werden gespiked met faagoplossing FoX2 + FoX4 van 2.106 tot 2.10-1 pfu/ml. De isolatie van gDNA werd uitgevoerd met de Qiagen DNeasy Powersoil Pro kit en 5µl hiervan werd toegevoegd aan de qPCR assay voor FoX2 en FoX4. De FoX2 qPCR gaf gedegradeerde FoX-faag aan maar de FoX4 qPCR assay vertoonde een duidelijke gradiënt van Ct-waarden overeenkomstig de toegevoegde faaghoeveelheden. De qPCR testen werden verder geëxploiteerd in het onderzoek. Taak 3: Bioassays voor bodemapplicatie van fagen in de kolenteelt en voor bladapplicatie van fagen in de preiteelt Bioassays preiAangezien Pspo infecties in de loop van dit project minder relevant bleken te zijn voor de praktijk (er worden de laatste jaren weinig tot geen Pspo infecties waargenomen) en we al eerder een werkende bioassay met fagen publiceerden (Rombouts et al. Front. Microbiol. 2016, 7, 1–15), hebben we ons vooral gefocust op bioassays in kool (zie verder).In het laatste jaar hebben we een andere bioassay ontwikkeld. Jonge preiplanten (Harston) werden hiervoor bespoten met faagoplossing en 0.05% Silwet Gold als uitvloeier. Na drogen (+/- 30 min) werd een bacterieoplossing gespoten op de planten. De topjes van de planten werden 14 dagen na infectie afgeknipt om de hoeveelheid bacteriën te kwantificeren via qPCR. Bij een MOI (multiplicity of infection; de faag:bacterie verhouding) van 10 is er een stijging van het aantal Pspo-negatieve planten, een resultaat dat voorzichtig positief is.Bioassays koolOp basis van WP2 (zie verder) werden FoX2 en FoX6 geselecteerd als optimale faagcocktail tegen Xcc. Zowel FoX2 als FoX6 werden vervolgens geëvalueerd in een irrigatie-gebaseerde faagtoepassing. Hiervoor werd eerst als preliminaire test de opname van de faag door de plant getest door een concentratiegradiënt aan faagcocktail FoX2/FoX6 (106 - 107 - 108 - 109 - 1010 PFU/mL) te voeden aan bloemkoolzaden (Giewont) als phytodrip (1 ml per zaad, 5 herhalingen, 4 zaden per herhaling). De negatieve controle zaden kregen faagbuffer. Na faagtoepassing in de bodem werden de zaailingen opgegroeid op 16°C onder een 16u/8u dag/nacht regime tot het BBCH10 groeistadium (14 dagen, eerste echte blad zichtbaar). Vervolgens werden de zaailingen uit de bodem getrokken en drie maal gewassen met 10 ml faagbuffer/0,1% Tween20 en eenmaal met steriel water om de externe fagen te verwijderen. Na homogenisatie werd het plantenmateriaal geresuspendeerd in 1 ml faagbuffer, waarna het werd gecentrifugeerd (10000 g). Tenslotte werd het supernatans gefilterd (0,45 µm) en werd de faagconcentratie van FoX2 en FoX6 bepaald door titratie op respectievelijk GBBC1419 en GBBC1412. Bij een behandeling van 106 en 107 PFU fagen konden geen fagen worden gerecupereerd uit het plantenweefsel, terwijl bij de hogere concentraties van behandelingen wel fagen konden worden geisoleerd uit de zaailingen, hetgeen aantoont dat de zaailingen wel degelijk de fagen opnemen en dat ze getransporteerd worden in de plant. De concentratie in de zaailingen is dosisafhankelijk en de minimale concentratie aan faag om fagen terug te kunnen vinden in de plant is 108 PFU/ml.Omdat we nu weten dat fagen worden opgenomen in de plant na phytodropbehandeling werd een bioassay uitgevoerd om de effectiviteit van deze faagbehandeling tegen Xcc infectie na te gaan. Hiervoor werden 150 bloemkoolzaden (Clarina) bij uitzaaien behandeld met 108 of 109 PFU faagcocktail. Vervolgens werden ze gedurende 5 weken opgegroeid en wekelijks behandeld met dezelfde hoeveelheid fagen als bij zaai door aangieten. Per plant werden dan vier bladeren geïnfecteerd met Xcc (GBBC1412 of GBBC1419; 10 planten per conditie) door ze in te knippen met een schaar die werd gedompeld in bacteriesuspensie (108 CFU/ml). De planten werden bewaard on hoge luchtvochtigheid en geëvalueerd na 10 dagen op Xcc symptomen. Deze bioassay toont aan dat behandeling met 109 PFU FoX2 voldoende is om infectie met GBBC1419 (invasief door een knip in het blad) te voorkomen (significant op p-value 0.0002). FoX6 behandeling werkt niet om infectie met GBBC1412 te voorkomen. Enkel FoX2 blijkt dus efficiënt te zijn in planta onder deze omstandigheden.Omdat Xcc infecteert via het blad werd behandelingen met FoX2 verder geëvalueerd in een bladbehandeling. In een eerste set-up werden de bacterie (GBBC1419) en faag gemengd in verschillende concentraties (107 CFU/mL met 106, 107 en 108 PFU/mL, gesupplementeerd met 0.025% Silwet Gold uitvloeier) en gespoten over jonge wittekool plantjes (2 herhalingen, 3 planten per herhaling). Na toepassing van de bacterie-faagcocktail werden de planten 14 dagen geplaatst onder hoge luchtvochtigheid voor het scoren van de Xcc symptomen. Deze proef toonde aan dat een spuitbehandeling aan MOI 10 (107 CFU/ml bacterie en 108 PFU/ml FoX2) resulteert in significant minder aangetast bladoppervlak en in significant minder infecties per blad. Bladbehandelingen aan lagere MOIs zijn niet effectief. In een tweede set-up werd een meer realistische situatie nagebootst door een faagbehandeling te doen alvorens de bacteriële infectie uit te voeren (ook via bespuiting aan 107 CFU/ml met 0.025% Silwet Gold). Dit werd in twee onafhankelijke herhalingen uitgevoerd met drie planten per conditie. Dit resulteerde in een symptoomreductie van 34% and 40% na een respectievelijke behandeling met MOI 10 en 100 (p = 0,0032 en 0,0008). Bij een MOI van 100 is er ook een significantie reductie van het aantal infectiepunten per blad (p = 0,0178).  Taak 4: Zaadbehandeling Zaadbehandelingen preiDe effectiviteit van de KIL3b en KIL5 cocktail werd getest in een zaadbehandeling. Hiervoor werden preizaden (Rijkzwaan) na sterilisatie (5% hypochloriet) en droging (1u) artificieel besmet met CFBP 1770 (OD 0.1) gedurende 16u. Na drogen (3u) resulteerde dit in 108 CFU/g besmettingsgraad. Vervolgens werden de zaden geweekt in faagoplossing (109 PFU/ml) en geïncubeerd gedurende 7 dagen in drie biologische herhalingen. Dagelijks werd de bacteriële concentratie in de zaden gemeten, alsook de faagconcentratie door 1 g zaad te homogeniseren in 1 ml PBS. Bacteriën werden gekwantificeerd op selectieve Pseudomonas P agar (Difco). Uit deze test bleek dat de bacteriële concentratie in niet-faagbehandelde zaden vrij constant bleef op 108 CFU/g. Na faagbehandeling, daalde de concentratie 2 log eenheden tot ongeveer 106 CFU/g. De faagconcentratie bleef ook vrij constant rond 107 PFU/g met een stijging op dag 2, dat aantoont dat er wel degelijk infectie en amplificatie is op de zaden. De zaden werden niet verder gekiemd.Zaadbehandelingen koolDe effectiviteit van zowel FoX2 als FoX6 werd geëvalueerd op zowel artificieel als natuurlijk geïnfecteerde bloemkoolzaden (Giewont). In de eerste artificiële set-up werden de zaden eerst gesteriliseerd met 5% javel, gespoeld met steriel water en gedroogd gedurende 1u in een laminaire flow. Hierna werden de zaden geschud in bacterieoplossing (GBBC1412 of 1419) gedurende 2u en terug gedroogd, resulterende in een finale concentratie van 108 – 106 – 104 CFU/g zaad. Hierna werden zowel steriele (controle) als geïnfecteerde zaden geweekt gedurende 18u op 16°C al dan niet in 108 PFU/ml faagoplossing. De bacterie- en de faagconcentratie werden gevolgd door 0.3 g zaden te homogeniseren in 1 ml PBS (fosfaatbuffer) en uitplating op semi-selectief medium voor Xcc (briljant cresyl blue-starch medium) in 6-voud. De overige zaden werden steriel gezaaid in 1/4e Murashine en Skoog medium gesupplementeerd met 10 g/l phytagel en opgegroeid gedurende 14 dagen op 16°C en onder een 16/8 dag/nachtregime. In de tweede set-up werden natuurlijk geïnfecteerde zaden (ter beschikking gesteld door een lid van de GG) behandeld met 108 PFU/ml fagen gedurende 18u en verder op dezelfde manier behandeld als de artificieel besmette zaden. De stam die deze zaden infecteerde werd eerst gevoelig getest op infectie met FoX2 of FoX6.Er is steeds een duidelijke reductie van het aantal bacteriën na zaadbehandeling met FoX2 of FoX6. Deze reductie is het hoogste bij artificieel besmette zaden (108 CFU/zaad) met een 1,5 of een 1,7 log reductie. Een lagere bacteriële concentratie (106 of 104) leidt tot een lagere reductie. Bij natuurlijke geïnfecteerde zaden werd een 1 of een 1,2 log reductie geobserveerd na behandeling met respectievelijk FoX2 en FoX6.   Werkpakket 2: Kwaliteit van de faagcocktail optimaliseren Taak 1: Isoleren van resistente bacteriën, testen op kruisresistentie tegen verschillende fagen en virulentietesten KIL fagen tegen PspoHet voorgaande LA traject resulteerde in 6 fagen specifiek voor Pspo: KIL1-5 en een H-mutant (een host range mutant die geëvolueerd werd om extra gastheren te herkennen) KIL3b die een iets groter bereik heeft dan KIL3 (Rombouts et al. Front. Microbiol. 2016, 7, 1–15). Alle Pspo stammen in collectie zijn gevoelig aan KIL3b en/of KIL5. Samen hebben deze fagen dus een gastheerspectrum van 100%. Er werden in de loop van dit project geen natuurlijk resistente bacteriën geïsoleerd uit veldstalen. Wel werden er resistente stammen gemaakt voor de receptoranalyse (WP2 Taak 3, zie verder). Sommige resistente stammen zijn resistent tegen zowel KIL3b als KIL5, terwijl andere stammen geen kruisresistentie vertonen.    De transposon mutant in OX88_RS20865 (coderende voor een membraaneiwit) werd getest voor zijn virulentie op prei. De bladeren van volwassen preiplanten van cultivar Krypton (Nunhems) werden hiervoor beschadigd met een naald. Vervolgens werd 100 µl bacteriesuspensie (108 CFU/ml) geïnjecteerd in het blad (5 planten, 3 bladeren per plant). 10 dagen na infectie werd de lesielengte gemeten.Ook werden er in het zaadbehandelingsrexperiment 4 bacteriën opgepikt die resistent waren aan KIL3b en KIL5. Deze werden gesequeneerd en een SNP analyse werd uitgevoerd (resultaten gepubliceerd in Holtappels et al., 2020; zie leverbaarheden). Deze mutanten vertonen ook puntmutaties in genen geassocieerd met LPS biosynthese. Hoewel de virulentie niet werd getest, kunnen we een verlaagde virulentie verwachten aangezien dit in literatuur al beschreven staat voor sommige van de gevonden LPS-mutanten (bv. wbpM, zie Creuzenet et al., Mol Microbiol 2001, 41, 1295-1310).FoX fagen tegen XccBij de start van dit LA project waren er al zeven fagen beschikbaar tegen Xcc: SoPhi1-7. Na herhaalde pogingen konden SoPhi5-7 niet gerecupereerd worden uit de beschikbare faagstocks, waaruit we konden besluiten dat deze fagen niet stabiel waren. In de loop van dit project werden drie nieuwe Xcc fagen geïsoleerd. Alle fagen werden hernoemd tot FoX1-7. Op basis van hun genoomsequentie, kunnen de FoX fagen ingedeeld worden in 3 clades. De eerste groep bestaat uit FoX1, FoX2, FoX3 en FoX5. FoX4 vormt een aparte groep en FoX6 en FoX7 vormen een derde groep. De FoX1-achtige fagen vormen nieuwe faagspecies, verwant aan het Jilinvirus genus aangezien ze een vergelijkende genoomarchitectuur hebben. FoX4 vormt ook een nieuw faagspecies, van ver verwant met leden van het Sanovirus genus. FoX6 en FoX7 tenslotte zijn hetzelfde species als de reeds beschreven faag Carpasina.Tussen 2011 (start voorgaande LA traject) en 2020 werden in totaal 68 verschillende Xcc stammen geïsoleerd van een diverse collectie aan Brassica spp. Alle Xcc stammen in collectie werden getest op gevoeligheid aan de verschillende FoX fagen. Hieruit bleek dat de FoX1-achtige fagen een parallel gastheerspectrum hebben aan FoX4, FoX6 en FoX7. Er zijn dus geen stammen beschikbaar die efficiënt door beide faagtypes kunnen worden geïnfecteerd. Als we enkel de lokaal geïsoleerde stammen in beschouwing nemen, kunnen FoX2 en FoX6 gezamenlijk 80% van de collectie infecteren. Er zijn een aantal resistente stammen beschikbaar. Om een idee te hebben van hoe onze Xcc collectie er uit ziet en of deze representatief is voor een bredere collectie werden 24 stammen (gevoelig of resistent aan de fagen) geselecteerd en geanalyseerd door whole genome sequencing. Deze sequenties werden gesupplementeerd met beschikbare Xcc genoomsequenties van NCBI en vervolgens werd een core genome analyse gedaan.Een phylogenetische analyse van de data toont dat er 4 Xcc clusters zijn. Onze collectie bevat isolaten uit elk van deze clusters en is dus wel degelijk representatief. De FoX1-achtige fagen kunnen isolaten uit twee clusters infecteren, terwijl FoX4 en FoX6 isolaten uit de vier clusters kunnen infecteren. Onze collectie bevat resistente stammen uit twee clusters. Deze zijn steeds resistent tegen alle fagen.Een aantal resistente GBBC1419 stammen bekomen uit de receptoranalyse (zie verder) werden geëvalueerd op hun virulentie en vergeleken met de wildtype GBBC1419. Enkel een mutant in een epimerase/dehydratase proteïne vertoont een significant lagere virulentie. De andere mutanten vertonen ook zichtbaar een lagere virulentie, zij het niet significant. Taak 2: Isolatie van H-mutanten KIL fagen tegen PspoAangezien alle Pspo stammen uit onze collectie kunnen geïnfecteerd worden door KIL3b en/of KIL5 was er geen noodzaak om een H-mutant te evoluëren.FoX fagen tegen XccIn het begin van het project waren er enkele stammen resistent tegen de toen beschikbare fagen. In de loop van het project werd de faagcollectie aangevuld met een aantal nieuwe isolaties op resistente stammen. Maar er zijn nog steeds stammen die resistent zijn aan alle fagen. Tot nu toe konden hier geen fagen tegen worden geïsoleerd of geëvolueerd. Aangezien FoX2 en FoX6 gezamenlijk 80% van de collectie infecteren, werd verder gegaan met deze faagcocktail. Taak 3: Faag receptoranalyse m.b.v. transposon mutagenese KIL fagen tegen PspoTijdens de eerste biënnale werd de focus gelegd op de verdere moleculaire karakterisatie van de bacteriofagen uit de geselecteerde cocktail KIL3b en KIL5 om alzo een faagcocktail te hebben waarbij de kans op resistentieontwikkeling minimaal is. Een protocol gebaseerd op transposon mutagenese (details gepubliceerd in Holtappels et al. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 2930) leverde verschillende eiwitten op betrokken in biosynthese van LPS voor KIL3b, terwijl een hypothetisch membraaneiwit werd geïdentificeerd voor KIL5. LPS is dus waarschijnlijk de primaire receptor van KIL3b terwijl KIL5 mogelijks een membraaneiwit herkent als receptor. Door complementatie van het dTDP-4-dehydrorhamnose reductase (gecodeerd door dhrr) of het membraaneiwit (gecodeerd door OX88_RS20865) en adsorptietesten werden deze receptoren bevestigd. We kunnen bijgevolg besluiten dat KIL3b en KIL5 een andere receptor herkennen en dus complementair zijn in de cocktail met een lagere kans op resistentieontwikkeling.FoX fagen tegen XccDezelfde techniek werd gebruikt om de receptor van FoX2 en FoX6 te identificeren. Voor beide fagen lijkt LPS de receptor te zijn. Voor FoX2 lijkt EPS (exopolysaccharide) een mogelijks secundaire receptor aangezien een mutant van het epimerase/dehydratase eiwit ook resistentie geeft tegen FoX2. De receptoren werden bevestigd als zijnde belangrijk voor adsorptie door een adsorptietest uit te voeren met fluorescent gekleurde fagen en vervolgens via microscopie de fluorescentie te kwantificeren. Voor beide fagen lijkt de wxc gencluster belangrijk te zijn voor faaginfectie.   Vervolgens toonden we aan dat variatie in de wxc gencluster (LPS biosynthese) verantwoordelijk is voor het parallelle gastheerspectrum van de FoX-fagen. De gencluster werd hiervoor geëxtraheerd uit de genoomdata (zie hierboven) en gebruikt voor een MLST analyse. De stammen splitsen mooi uit in de FoX1-gevoelige stammen en de FoX4/6-gevoelige stammen. Voor de faagcocktail tegen Xcc zal er dus steeds een combinatie nodig zijn van twee fagen die elk van deze groepen kunnen infecteren. Taak 4: Verifiëren van transductiepotentieel Een protocol werd opgesteld om het transductiepotentieel van de verschillende fagen te testen. Hierbij werden fagen opgegroeid op een stam met een antibioticumresistentiemerker. Deze fagen werden vervolgens gebruikt om een antibioticumgevoelige stam te infecteren. De infectie werd gestopt en de bacteriën werden uitgeplaat op selectief medium. In het geval van de fagen van de twee cocktails (KIL3b – KIL5 en FoX2 – FoX6) werden geen resistente bacteriën teruggevonden. Dit gecombineerd met de sequencing data doet vermoeden dat deze fagen niet transduceren. Echter, er is geen positieve controle (een gekende transducerende faag) voor handen om de werking van het protocol te verifiëren. Taak 5: Optimalisatie faagproductie en opzuivering In eerste instantie werd de productie van de fagen geoptimaliseerd door verschillende gastheren en incubatietijden te variëren. Zo werd de productie van de verschillende fagen geoptimaliseerd tot een productie van 1010 - 1012 pfu/ml. Tijdens werkjaar 1 werd ook gefocust op de opzuivering van de KIL fagen voor Pspo met CIM anion-exchange chromatografie. De recovery voor deze fagen (hoeveel fagen die geladen worden ook effectief elueren) werd geoptimaliseerd en ligt tussen de 50 en 80% terwijl de capaciteit ligt tussen 1.109 tot 2.1011 fagen per ml kolomresin. Deze waarden zijn vergelijkbaar met wat tot nu toe in de literatuur werd beschreven. Voor de FoX2 en FoX6 fagen van Xcc werd de FPLC opzuivering ook geoptimaliseerd met een DEAE anionenuitwisselaar. De maximale bindingscapacitiet van de twee fagen bedraagt 1.49x1012 PFU en 1.12x1013 PFU per ml resin voor respectievelijk FoX2 en FoX6. Na elutie blijven 74% van de FoX2 en 47% van de FoX6 partikels infectieus. Deze opzuiveringen werden gebruikt om genoeg fagen te produceren voor alle bioassays en veldproeven. Taak 6: Verifiëren van de faagstabiliteit en de invloed van additieven hierop De stabiliteit van de fagen werd getest in verschillende pH en temperatuur condities. Zo werd een pH range van 3 tot 11 en een temperatuur range van 4°C tot 37°C getest. Hieruit is gebleken dat de fagen stabiel zijn in een range van pH 4 tot 10 en op alle geteste temperaturen voor een periode van twee weken. Verder werd de stabiliteit van de fagen getest in verschillende bladuitvloeiers: Silwet Gold veroorzaakt een kleine reductie in de concentratie van faag, Trend heeft een duidelijke negatieve invloed heeft op de faagstabiliteit, S70 en R11 hebben haast geen invloed. De fagen zijn stabiel genoeg om zo gebruikt te worden in de bioassays en veldproeven.   Werkpakket 3: Monitoring van bacterie- en faagpopulatie Taak 1: Bodembesmetting in kaart brengen In dit werkpakket wordt de bacterie-en faagpopulatie in Vlaanderen in kaart gebracht door monitoring van besmette kool- en prei-percelen. In de eerste biënnale werden minder stalen van besmet plantenmateriaal en besmette bodem genomen dan voorzien in het projectvoorstel. Dit was te wijten aan de droge zomers. Een trend die zich in de daaropvolgende jaren heeft voortgezet, met slechts enkele meldingen van aantasting, welke na analyse niet allemaal Pspo of Xcc bleken te zijn. Tijdens de staalnames werd wel vastgesteld dat Xcc enkel aan of in de wortels van zieke koolplanten konden worden aangetoond en niet in de grond als dusdanig. Daarnaast bleek dat de detectie van Xcc in de grondstalen op semi-selectief medium een lage gevoeligheid vertoonde (ongeveer 106 Xcc/gram). Taak 2: Toetsen faagcocktail aan nieuwe Xcc en Pspo isolaten Een belangrijke taak in dit werkpakket is het toetsen van nieuwe isolaten van Xcc en Pspo aan deze verkregen in het IWT project 100881. Zo kan nagegaan worden of de bacteriepopulatie verandert met de tijd. Nieuwe introducties zijn mogelijk omdat de zaadteelt op verschillende geografische locaties in de wereld plaatsvindt. Er werden meerdere nieuwe isolaten van Xcc en Pspo verkregen uit diagnostische kool- en preimonsters die werden aangeleverd door de praktijkcentra in het project. In de DNA barcode gyrB werden voor Xcc genetische verschillen aangetoond. In de DNA barcode rpoD voor Pspo werden geen genetische verschillen aangetoond. Eveneens werd getest of de bij de projectstart beschikbare fagen de nieuwe bacterie-isolaten konden infecteren. Hieruit is gebleken dat tien van de dertien nieuwe isolaten konden gelyseerd worden door de toenmalige Xcc fagen in collectie. Dit onderstreept het belang om continue faagscreenings uit te voeren zodat de faagcocktail up to date blijft. De faagcocktail werd verder uitgebreid en gekarakteriseerd. Taak 3: Screening faagpopulatie Tenslotte gebeurde in dit WP ook een screening van de faagpopulatie. Indien mogelijk werd bij elk plantenstaal aangetast door bacterieziekte ook een bodemstaal geanalyseerd op aanwezigheid van fagen. Er werden vier nieuwe FoX fagen geïsoleerd die effectief blijken te zijn tegen enkele resistente stammen (GBBC 3217 – GBBC 3236 – GBBC 3228). Deze fagen werden toegevoegd aan de bestaande faagcocktail.   Werkpakket 4: Implementatie & disseminatie Het doel van dit werkpakket was enerzijds een brede bewustmaking over bacteriofagen als ecologisch verantwoorde bestrijder en anderzijds de instructie over praktijktoepassing. Gedurende de 1ste biënnale werden al stalen genomen bij groentetelers die kampen met bacterieziekte ter monitoring van de bacterie- en faagpopulatie en ter uitbreiding van de faagcocktail. Aan deze telers werd bijgevolg ook advies gegeven over preventieve en hygiënische maatregelen. Dit werd verdergezet tijdens de tweede biënnale, hoewel het aantal meldingen van aantasting zeer laag is gebleven. Door de lage ziektedruk kon de mijlpaal van 450 adviezen helaas niet bereikt worden.In de laatste biënnale werd sterk ingezet op demonstratieproeven op de praktijkcentra, dit zowel in prei als kolen. Door de droge zomers was het moeilijk om, ondanks kunstmatige infectie, aantasting te verkrijgen in de preiproeven. Hieruit konden daarom geen resultaten bekomen worden. In 2017 hebben we wel twee kleine proeven kunnen aanleggen op een praktijkveld met natuurlijke infectie. Daar kon reeds positief effect vastgesteld worden van de toepassing van de faagcocktail (KIL3b + KIL5), in combinatie met Silwet Gold, op de aantasting. De veldproeven in kolen waren meer succesvol. Daarvoor werd gewerkt met een kunstmatige infectie, door verneveling van een bacteriesuspensie (106 cfu/ml) over het gewas. In 2018 werd voor het eerst ook ingezet op preventieve toepassingsmethoden, welke veelbelovend bleken. De daaropvolgende jaren werden deze dan ook aangelegd in de veldproeven. In 2019 werden enkel in Sint-Katelijne-Waver goede resultaten bekomen, waar opnieuw een preventieve methode, daar fytodrip met faagcocktail (108 pfu/ml), werkzaam bleek. Tijdens het laatste projectjaar werd een combinatie van fytodrip, plantbakbehandeling en aangieten met de faagcocktail (FoX2 + FoX6) (108 pfu/ml) (wekelijks of driewekelijks) uitgetest, naast een gewasbespuiting van de faagcocktail met CaCl2. Hoewel aangieten uit eerder onderzoek (met jonge plantjes) potentieel leek te hebben, waren het de gewasbespuitingen die voor significante reducties konden zorgen, zowel op het PCG als PSKW. Waarschijnlijk had de invloed van de grootte van de planten en de weersomstandigheden een effect negatief effect op de aangietmethode. Positieve effecten van het aangieten werden wel waargenomen bij Inagro en PSKW. Daarnaast werd dan weer verwacht dat de toevoeging van CaCl2 een verbeterde faagadsorptie op de bacteriën verzorgd, wat in de resultaten zichtbaar was. In de loop van het project verschenen verschillende artikels (o.a. in Landbouwleven, Proeftuinnieuws, etc.) en werd informatie van het project naar de academische wereld verspreid via presentaties op symposia. Zo werd het project o.a. voorgesteld op het Viruses of Microbes congres aan de Universiteit van Wroclaw (Polen), de Evergreen Phage meeting aan de Evergreen State College (Olympia, WA, USA); de Oxford phage meeting (Oxford, UK), het Biocontrol 2019 congres (Vitterbo, Italië), het symposium on Crop Protection aan de Ugent, aan de KU Leuven tijdens de 1st Plant-Microbe Interaction day, VIROPLANT meeting en A2H Symposium. Op 5 september 2018 werden ruim 200 bezoekers van het Internationaal Koolcongres rondgeleid op het koolplatform van Inagro waar ze een toelichting kregen rond het bacteriofaag onderzoek. Via rondleidingen op de verschillende praktijkcentra werden ook al heel wat uit de fytowereld en studenten geïnformeerd over het project en de problematiek in kolen en prei.Op Plattelandspret (tvoost) werd een korte reportage gemaakt over het project, waarbij verschillende aspecten van het onderzoek werd aangehaald (veldproeven, bioassays, labo-onderzoek). Aflevering 22, 2/11/2019: https://www.tvoost.be/programmas/plattelandspret-plattelandspret-afl-22-2019-87460 Er werden vier artikels in vaktijdschriften gepubliceerd:-          Preventieve faagbehandeling loont in de strijd tegen bacterieziekten (Proeftuinnieuws 4, 22/02/2019)-          Virussen op het veld zijn geen science-fiction (KU Leuven, Departement Biosystemen, 27/02/2020)-          Virussen kunnen gewassen beschermen (Boer&Tuinder, 12/03/2020)-          Bacterieziekten onderdrukken met fagen weer een stap dichterbij (Proeftuinnieuws 19, 6/11/2020)Volgende wetenschappelijke artikels werden reeds gepubliceerd. Het artikel over Xcc is klaar om ingediend te worden:-          Holtappels, D., Lavigne, R., Huys, I. en Wagemans, J. Protection of phage applications in crop production: a patent landscape. 2019. Viruses, 11, 277; doi: 10.3390/v11030277-          Holtappels, D., Kerremans, A., Busschots, Y., Van Vaerenbergh, J., Maes, M., Lavigne, R. en Wagemans, J. Preparing for the KIL: receptor analysis of Pseudomonas syringae pv. porri phages and their impact on bacterial virulence. 2020. International Journal of Molecular Sciences, 21, 2930; doi: 10.3390/ijms21082930-          Akremi, I., Holtappels, D., Brabra, W., Jlidi, M., Hadj Ibrahim, A., Ben Ali, M., Fortuna, K., Ahmed, M., Van Meerbeek, B., Rhouma, A., Lavigne, R., Ben Ali, M. en Wagemans, J. First report of filamentous phages isolated from Tunisian orchards to control Erwinia amylovora. 2020. Microorganisms, 8, 1762; doi: 10.3390/microorganisms8111762-          Holtappels, D., Fortuna, K., Lavigne, R. en Wagemans, J. The future of phage biocontrol in integrated plant protection for sustainable crop production. 2021. Current opinion in Biotechnology, 68: 60-71.-          Holtappels, D., Fortuna, K., Moons, L., Broeckaert, N., Bäcker, L., Vennemand, S., Rombouts, S., Lippens, L., Baeyen, S., Pollet, S., Noben, J.P., Oechslin, F., Vallino, M., Aertsen, A., Maes, M., Van Vaerenbergh, J., Lavigne, R. en Wagemans, J. Development of an integrated pest management strategy to control Xanthomonas campestris pv. campestris based on bacteriophages. Ready for submission.  Werkpakket 5: Wetgeving & intellectuele bescherming Taak 1: Europese erkenningsprocedure voor bacteriofagen verduidelijken Om faagtherapie op een veilige manier toe te passen, is een wettelijk kader nodig. Regelgeving is hierbij een grote uitdaging. Het eerste doel van dit werkpakket was de erkenningsprocedure verduidelijken. In de Europese commissie zijn nog geen faagproducten op de markt zijn, m.u.v. een Hongaars product ‘Erwiphage Plus’ tegen Erwinia amylovora infecties bij appel en peer dat enkel lokaal toegelaten is tijdens een bepaalde bloeiperiode (dient elk jaar terug goedgekeurd te worden). Dit valt dan onder een noodprocedure waarbij een lidstaat van de EU zelf een tijdelijke authorisatie kan goedkeuren.Na overleg met GAB (een Europees bedrijf die registratie van plant protection products begeleid) werd duidelijk dat faaggebaseerde (bio)pesticides momenteel wel degelijk onder dezelfde wetgeving vallen als andere plant protection products (PPPs) en dus ook hieraan moeten voldoen (de PPP regulation (EC) 1107/2009). Dit wil zeggen dat net zoals voor chemische pesticiden eerst de actieve bestanddelen moeten worden goedgekeurd door de Europese Commissie alvorens een finaal PPP kan worden geauthoriseerd in de verschillende lidstaten. De Europese Commissie wordt voor de goedkeuring van actieve stoffen geinformeerd door de verschillende lidstaten en door EFSA (European Food Safety Authority). Om een actieve stof te laten goedkeuren moet de veiligheid (voor mens, dier en omgeving) ervan aangetoond worden. Eens de actieve stof is goedgekeurd, dan geldt dit voor 10-15 jaren. Het dossier dat moet worden ingediend volgt wetgeving (EU) 283/2013. Het ingevulde dossier wordt doorgestuurd naar een lidstaat (‘de Rapporteur Member State/RMS’) die het dossier ontvankelijk verklaart en een voorlopig rapport voorbereid voor EFSA die vervolgens een peer review uitvoert en een conclusie formuleert voor de ‘Standing Committee for Food Chain and Animal Health’ van de Europese Commissie. Dergelijk proces duurt minstens ongeveer 3,5 jaar. In de Europese Unie zijn er momenteel 7 virus-gebaseerde actieve bestanddelen al goedgekeurd (voornamelijk baculovirussen en geattenueerde plantvirussen.Enkele andere bestanddelen zijn nog in aanvraag. Een belangrijke opmerking bij fagen als actieve bestanddelen is dat deze kunnen vallen onder de ‘low risk substances’ net zoals andere biologicals. De voordelen zijn dat een lagere hoeveelheid efficacy trials nodig zijn, er een ‘fast-track’ authorisatie procedure mogelijk is, en dat deze bestanddelen ineens zijn goedgekeurd voor 15 jaar ipv 10 jaar. Ook is er een langere protectie op de veiligheidsstudies (13 jaar ipv 10 jaar), zodat je producten langer IP-gewijs beschermd zijn van reproductie door een concurrent.  Eens elk actief bestanddeel is goedgekeurd, dan kan het PPP aanvraagdossier worden opgesteld volgens wet (EU) 284/2012. In dit dossier wordt niet meer geoordeeld over de veiligheid, maar het gebruik (welke gewassen, hoeveelheid van applicatie, …) dient verduidelijkt te worden. Productregistratie gebeurd in zones van de EU (Noord, Centraal en Zuid), waarbij terug 1 lidstaat per zone wordt gekozen om het dossier in te dienen. Enkele specifieke aandachtspunten voor faagcocktails als PPP: fagen hebben een nauw gastheerspectrum, een faagcocktail is daarom absoluut nodig. Die faagcocktail is één van de pijnpunten om faagproducten als PPP te laten erkennen. Tijdens de 1ste GG kwam de vraag naar identiteit: ‘Hoe sterk lijken fagen op elkaar?’. Taxonomie van fagen is de verantwoordelijkheid van het ‘Bacterial and Archaeal Viruses Subcommittee’ (onderdeel van het ‘International Committee on the Taxonomy of Viruses’). Momenteel wordt een faagspecies gedefinieerd als zijnde identiek aan een ander virus als deze fagen op DNA-niveau minstens 95% gelijkenis vertonen (Adriaenssens en Brister, 2017). Deze regel zal enorm belangrijk zijn voor de registratie van een faagspecies als actieve stof in een biopesticide. Fagen die minder dan 5% verschillend zijn op basis van hun genoom, maar eventueel wel voldoende verschillend zijn om een ander gastheerspectrum te hebben (dit kan bijvoorbeeld enkel door enkele puntmutaties in hun staartvezelgenen), zullen immers als 1 actieve stof dienen te worden geregistreerd. Ook als de fagen in het product door de jaren heen lichtjes evolueren door natuurlijke evolutie op hun gastheer, valt deze faag nog steeds onder hetzelfde registratiedossier zolang er minder dan 5 nucleotiden op 100 nucleotiden verschil is met het originele product.We ondervinden duidelijk dat faagtherapie in beweging is in Europa, in diverse sectoren. Dit wordt dan ook verder opgevolgd binnen andere faagonderzoeksprojecten (H2020 VIROPLANT, Era-Net ANIHWA, JPI-AMR AntiBio-Lab, samenwerking met brandwondencentrum, etc.). Taak 2: Mogelijkheden voor intellectuele bescherming verduidelijken Het tweede doel van dit werkpakket was de patenteerbaarheid van faag-gebaseerde producten in de landbouw verduidelijken. KULeuven heeft hierover een artikel gepubliceerd om dit te doen. De belangrijkste punten die bevonden:-          49 patentfamilies rond fagen voor gewasbescherming werden geïdentificeerd in patentdatabanken, met een stijgend aantal patenten de laatste jaren (laatste update op 17/2/2019) -          Deze stijging loopt samen met het stijgende aantal wetenschappelijke publicaties -          De meeste patenten worden ingediend door non-profit organisaties uit Azië -          Goedgekeurde patenten lijken eerder brede claims te hebben (b.v. ze claimen fagen in het algemeen voor een bepaalde toepassing ipv een specifieke faag) en gaan meestal over de applicatiemethode Alle bevindingen kunnen uitgebreid nagelezen worden in Holtappels et al. Viruses 2019, 11, 277. Naast de mogelijkheid die er wel degelijk is om een faagcocktail of het gebruik ervan te patenteren, is de procedure zoals besproken onder taak 1 ook een bescherming voor het bedrijf dat een faagcocktail wil commercialiseren. De verschillende studies die gebeuren voor een actieve stof dossier zijn immers ook beschermd voor de aanvrager gedurende 10 jaren (of 13 jaar voor biologicals). Hierdoor kan een concurrent enkel een product met de goedgekeurde fagen op de markt brengen als deze een licentie betaald aan de aanvrager van het actieve stof dossier. Dit biedt dus een extra bescherming." "Biotoegankelijkheid en vertering van nutriënten in Bambara aardnoten: invloed van opslagcondities en procesvoering" "Tara Grauwet" "Afdeling: Centrum voor Levensmiddelen- en Microbiële Technologie" "Inheemse peulvruchten zijn lokaal aangepaste en duurzame levensmiddelen die voedselzekerheid en gezondheid in ontwikkelingslanden kunnen verbeteren. Naast problemen inzake voedselzekerheid, blijft malnutritie een onopgelost probleem blijft. Peulvruchten kunnen na de oogst lang bewaard worden, wat ze een betrouwbare voedselbron maakt in tijden van honger. Tijdens langetermijnbewaring van gedroogde peulvruchten kunnen verschillende biochemische reacties optreden, zoals beschreven door verschillende hard-to-cook (HTC) theorieën. De ontwikkeling van het HTC fenomeen is niet enkel onpraktisch (toegenomen energiekost voor de bereiding leidt tot afgenomen aanvaardbaarheid voor consumenten), maar heeft ook potentieel negatieve gevolgen voor de nutritionele kwaliteit van peulvruchten. Daarom had dit doctoraatsonderzoek tot doel de invloed van bewaring en procesvoering op structurele eigenschappen te bestuderen, en de consequenties hiervan op de nutritionele kwaliteit van micro- en macronutriënten van Bambara aardnoten te evalueren.Het eerste deel van het werk levert bewijs dat de ontwikkeling van het HTC fenomeen in Bambara aardnoten wel degelijk plaats vindt, wanneer deze bewaard werden onder typische sub-sahara omgevingsomstandigheden (35 °C en 78 % relatieve vochtigheid). Met toenemende bewaartijd (veroudering), vertraagde de afname van de hardheid tijdens koken en werd celsplitsing uitgesteld. Er werd verondersteld dat de geobserveerde veranderingen veroorzaakt worden door het versterken van de celwand en middenlamellen door de vorming van mineraal-pectine cross-links of door cross-linking van polyfenolen met andere celwandpolymeren tijdens bewaring.In het tweede deel van het werk werden enkele theoretische consequenties van de HTC theorieën op de retentie en biotoegankelijkheid van mineralen en zetmeelverteerbaarheid onderzocht. Weken en verlengde kooktijden veroorzaakten hoge verliezen van Mg, Fe en Zn door uitloging. Dit resultaat werd gelinkt aan het in de literatuur besproken verlies van membraanintegriteit tijdens de veroudering van peulvruchten (lipide-oxidatietheorie). Echter, Ca loogde amper uit tijdens weken en koken. Vermits de bestudeerde mineralen in verschillende mate uitloogden, werd de gebonden status van mineralen door de matrix van naderbij bekeken. De hoeveelheid oplosbare mineralen werd bepaald in een dispersie van bloem van verse en bewaarde rauwe bonen in water. Van de vier bestudeerde mineralen, bleek enkel het oplosbaar Ca-gehalte opmerkelijk te dalen met bewaring. Om dit verder te begrijpen, werden cross-secties van rauwe verse en bewaarde Bambara aardnoten bestudeerd met behulp van fluorescentiemicroscopie, wat de aanwezigheid aantoonde van meer gelabelde Ca-pectine cross-links in bewaarde stalen. De toename in Ca-complexatie met bewaring kan geassocieerd worden met bepaalde aspecten van de pectine-kation-fytaattheorie. Omdat de kennis van hoeveelheden gebonden mineralen niet voldoende is om hun uiteindelijke vrijzetting tijdens digestie te begrijpen, werd de mineraalbiotoegankelijkheid bepaald. Voor elk van de bestudeerde mineralen werden verschillende trends geobserveerd. Ca-biotoegankelijkheid nam af met bewaring maar verbeterde met kooktijd. Mg-biotoegankelijkheid nam af met zowel bewaring als kooktijd, terwijl de biotoegankelijkheid van Fe en Zn niet erg beïnvloed werd door de toegepaste stappen in de peulvruchtenketen. De integriteit van de cotyledoncelwand is een belangrijke eigenschap die de zetmeelverteerbaarheid bepaalt. Vermits verschillen in celwandstructuur, zoals meer Ca-pectine cross-links en uitgestelde celsplitsing, werden vastgesteld in bewaarde Bambara aardnoten in vergelijking tot minder lang bewaarde stalen, werd zetmeelverteerbaarheid bestudeerd voor zowel verse als bewaarde stalen. Een snellere zetmeelvertering werd vastgesteld in bewaarde ten opzichte van verse Bambara aardnoten die een vergelijkbare thermische behandeling ondergingen. Door een hogere graad van celbreuk in bewaarde stalen, had amylase een vlottere toegang tot het substraat. Het zetmeelverteringsgedrag van verse en bewaarde stalen met gelijkaardige hardheid en microstructuur (vooral individuele cellen) was vergelijkbaar. Deze resultaten sloten een directe invloed van de ontwikkeling van het HTC fenomeen op zetmeelvertering uit.De karakteristieke microstructuur van Bambara zaden met eetbare hardheid bestond uit individuele cellen na mechanische desintegratie (zoals bijvoorbeeld relevant tijdens kauwen). Daarom werd in het laatste deel van dit werk het effect van procesintensiteit en hardheidsortering op de zetmeel- en proteïneverteerbaarheid geëvalueerd voor geïsoleerde individuele cellen. Individuele cellen die een langere kooktijd ondergingen, vertoonden een snellere zetmeel- en proteïneverteerbaarheid. Er was bovendien een aanzienlijke diversiteit in de hardheid van zaden na koken en de zaden werden daarom verdeeld in klassen van hoge tot lagere hardheid. Individuele cellen van zaden uit de hoge hardheidsklasse hadden een lagere en langzamere zetmeel- en proteïneverteerbaarheid. De geschatte kinetische parameters voor zetmeel- en proteïneverteerbaarheid waren sterk gecorreleerd.Uit deze doctoraatsthesis kan geconcludeerd worden dat bewaring een belangrijk maar weinig bestudeerde fase is in de verwerkingsketen van peulvruchten die, rekening houdend met procesvoering, de nutritionele kwaliteit van peulvruchten beïnvloedt. Bovendien kunnen hardheid en de gekoppelde microstructuur gebruikt worden als een algemene variabele om de zetmeel- en proteïneverteerbaarheid preciezer af te stemmen." "Onderzoek naar de functionaliteit van biopolymeren en gerelateerde watermobiliteit in de keten van bloem tot brood" "Jan Delcour" "Afdeling: Centrum voor Levensmiddelen- en Microbiële Technologie" "Brood is het voornaamste product gebaseerd op tarwe en is een basisvoedingsmiddel in de Westerse wereld. Brood past uitstekend in een gezond voedingspatroon aangezien het een goede bron van energie, vezels, vitaminen en mineralen is. Helaas wordt 25% van al het geproduceerde brood verspild, en dit voornamelijk door de consument. Consumenten verkiezen vers brood met een zacht, maar versnijdbaar kruim, een knapperige korst en de gewenste smaak en aroma’s. Tijdens bewaring verstevigt het kruim, wordt de korst taai en gaan de gewenste smaak en aroma’s verloren zodat het brood niet meer acceptabel is voor de consument. Om de problematiek van kruimverharding op efficiënte wijze aan te pakken, is grondige kennis van de transformaties van broodconstituenten tijdens de broodbereiding en de impact ervan op het verouderingsmechanisme vereist. Hoewel de bijdrage van verschillende broodconstituenten aan de eigenschappen van vers en bewaard brood relatief goed gekend is, blijft het inzicht in de exacte ‘timing’ en mate van structuurwijzigingen tijdens de broodbereiding beperkt.Essentiële ingrediënten voor de broodbereiding zijn tarwebloem, water, gist en zout. Kwantitatief gezien is zetmeel de belangrijkste bloemcomponent. Het draagt in belangrijke mate bij tot de eigenschappen van vers en bewaard brood. Zetmeel bestaat voornamelijk uit amylopectine (AP)- en amylose (AM)- moleculen die georganiseerd zijn in gedeeltelijk kristallijne granulen. De kristalliniteit van zetmeel wordt voornamelijk aan AP toegeschreven.Wanneer zetmeel wordt verwarmd in aanwezigheid van voldoende water, zoals tijdens het broodbakproces, treedt verstijfseling op waarbij de orde van zetmeelgranulen verloren gaat. Verstijfseling gaat gepaard met een aanzienlijke wateropname en dus zwelling van de granulen, uitloging van AM buiten de granulen en afsmelting van de AP-kristallen. Wanneer en in welke mate deze fenomenen optreden tijdens bakken, is afhankelijk van de concentratie en de structuur van AM en AP in zetmeel. Wanneer brood kan afkoelen, vindt gelering van AM plaats. (Uitgeloogde) AM-moleculen kristalliseren en vormen een netwerk doorheen broodkruim. Samen met het glutennetwerk dat wordt gevormd tijdens bakken, draagt dit netwerk bij tot de gewenste textuureigenschappen van vers broodkruim. Tijdens bewaring treedt rekristallisatie van AP op zodat het zetmeelnetwerk verstevigt. Water, dat werd onttrokken aan het glutennetwerk, wordt in dit zetmeelnetwerk geïmmobiliseerd. Samen met de herverdeling van water tussen kruim en korst zorgt dit voor uitdroging en (verdere) verharding van gluten- en zetmeelnetwerken, en dus van kruim.Als vertrekpunt voor het onderzoek naar de functionaliteit van zetmeel en zijn interactie met water tijdens de bereiding van tarwebrood, werd in een eerste deel van dit doctoraatsproefschrift een literatuurstudie over de eigenschappen van tarwezetmeel en de rol ervan tijdens de broodbereiding- en bewaring uitgevoerd. Nuttige analytische benaderingen in deze context werden eveneens vermeld. Wijzigingen van zetmeel en de herverdeling van water tijdens de broodbereiding en -bewaring kunnen nauwkeurig geanalyseerd worden met ‘time domain’ proton nucleaire magnetische resonantie (TD 1H-NMR). Deze techniek kan op temperatuur-gecontroleerde wijze worden toegepast om wijzigingen in de zetmeel- en waterfractie in brood op te volgen terwijl het bak-, en later het afkoelproces, plaatsvindt. Hoewel veranderingen van zetmeel tijdens de koelfase cruciaal zijn voor de kwaliteit van vers brood, werd dit proces tot dusver niet bestudeerd met temperatuur-gecontroleerde TD 1H-NMR. NMR-metingen op deeg werden overigens meestal uitgevoerd tijdens stapsgewijze opwarming, hetgeen niet representatief is voor het broodbakproces. De experimentele gegevens die met NMR-analyses worden verzameld, zijn complex. Voor zover we weten werden deze gegevens tot nog toe niet geïnterpreteerd in combinatie met andere technieken die de kristalliniteit van zetmeel en zijn zwel- en uitloginsgedrag meten.In dit kader was het doel van dit doctoraatsonderzoek een vernieuwende ‘toolbox’ gebaseerd op temperatuur-gecontroleerde TD 1H-NMR te ontwikkelen zodat zetmeeltransities en de herverdeling van water in deeg en brood bestudeerd kunnen worden tijdens een opwarm- en koelproces dat relevant is voor de broodbereiding. In een eerste deel van dit proefschrift werd aangetoond dat de combinatie van temperatuur-gecontroleerde TD 1H-NMR met tijdsafhankelijke metingen van X-stralen diffractie bij grote hoeken, differentiële ‘scanning’ calorimetrie (DSC) en colorimetrische en gravimetrische analyses van zetmeeleigenschappen, krachtige analysemogelijkheden biedt om wijzigingen in de zetmeel- en waterfractie in brood te bestuderen tijdens een bak- en koelproces. Zodoende werd een geïntegreerd beeld van verstijfselings- en geleringsfenomenen op verschillende lengteschalen ontwikkeld.De temperatuur-gecontroleerde NMR ‘toolbox’ werd vervolgens gebruikt om dieper in te gaan op de functionaliteit van AM en AP tijdens de broodbereiding. Unieke tarwebloemstalen met verschillende AM- en AP-karakteristieken en een efficiënt anti-broodverouderingsenzym, i.e. het maltogeen α-amylase uit Bacillus stearothermophilus (BStA) vormen in deze context uitstekende hulpmiddelen.Bloemstalen afkomstig van ‘near-isogenic’ tarwecultivars (NILs) verschilden uitsluitend op vlak van AM- en AP-eigenschappen. NIL 5-5 bloem bevatte minder AM en een hogere portie korte AP-ketens dan de controle, i.e. NIL 1-1 bloem. Verder werd tarwebloem met een zeer laag AM-gehalte in zetmeel gebruikt. Wanneer deeg bereid werd met deze bloemstalen, trad een verandering van het temperatuurbereik van verstijfseling en gelering op. De stabiliteit van AP-kristallen nam toe wanneer zetmeel minder AM bevatte zodat verstijfseling plaatsvond bij hogere temperaturen. Een grotere hoeveelheid korte AP-zijketens, die te kort zijn om stabiele kristallen te vormen, was daarentegen verantwoordelijk voor de afname van de AP-kristalstabiliteit. Dit uitte zich in lagere verstijfselingstemperaturen.Hoewel de hydrolyse van zetmeel door BStA eveneens een toename van zulke korte AP-zijketens veroorzaakte, bleef een verschuiving van de verstijfselingstemperatuur tijdens het bakken van brood bereid met BStA uit. Hieruit werd afgeleid dat BStA zetmeel slechts significant hydrolyseert nadat zetmeel begint te verstijfselen. Door inwerking van BStA op AM werd aan het eind van de bakfase een enigszins verzwakt zetmeelnetwerk met mobielere AM-moleculen bekomen. AM wordt dan ook als structuurvormer in broodkruim beschreven. Wanneer AM-concentraties in broodkruim lager waren, startte AM-kristallisatie bij lagere temperaturen, en dus later tijdens de koelfase. Bovendien werd een minder uitgebreid AM-netwerk met minder AM-kristallen gevormd. Dat protonen in dit netwerk mobieler bleven, duidde op een zachter vers broodkruim.Om het effect van AM- en AP-karakteristieken op de eigenschappen van vers en bewaard brood te onderzoeken, werd brood bereid met unieke bloemstalen of met toevoeging van BStA. Deze broden werden vervolgens bewaard bij kamertemperatuur. Het verouderingsmechanisme werd opgevolgd met TD 1H-NMR, DSC en textuurmetingen. Wanneer het AM-gehalte in brood lager was, werd het AM-netwerk slechts in beperkte mate gevormd. Vers, afgekoeld broodkruim was bijgevolg te zacht en niet versnijdbaar. Na 7 dagen bewaring was de kruimhardheid van brood dat weinig of geen AM bevatte bijna dubbel zo hoog als de kruimhardheid van bewaard controlebrood. Dit werd toegeschreven aan de sterk toegenomen mate van AP-rekristallisatie als gevolg van het zeer lage AM- en, dus, zeer hoge AP-gehalte van zetmeel in brood. Aangezien brood bereid met NIL 5-5 bloem of met toevoeging van BStA meer AP-zijketens bevatte die te kort zijn om te rekristalliseren, nam de hoeveelheid gekristalliseerd AP en de kruimhardheid tijdens 7 dagen bewaring maar half zoveel toe als in controlebrood.In het laatste deel van deze thesis werd niet de broodreceptuur maar het bakproces gewijzigd. Brood werd eerst slechts gedeeltelijk gebakken en pas na een intermediaire bewaarperiode volledig afgebakken. De impact van een variërende baktijd tijdens de eerste bakfase op de eigenschappen van vers en bewaard brood werd onderzocht. Met toenemende baktijd nam de veerkracht van kruim in vers, voorgebakken brood toe. Dit was te wijten aan de vorming van een meer uitgestrekt AM- en glutennetwerk. Een langere baktijd werd geassocieerd met een sterkere mate van AM-uitloging zodat meer AM-moleculen konden kristalliseren tijdens de koelfase. De verknoping van glutenproteïnen werd eveneens bevorderd.Tijdens de intermediaire bewaarfase, nam de mate van kruimverharding toe wanneer het brood gedurende langere tijd voorgebakken werd. Er werd aangenomen dat de uitloging van AM, en ook van AP, voortging wanneer de baktijd toenam. Zodoende werd een sterker ontwikkeld AM netwerk, met meer AM-kristallen die dienst doen als nuclei voor AP-retrogradatie, gevormd tijdens koelen. Bovendien werd zowel intra- als intergranulaire AP-retrogradatie bevorderd door de hogere AP-concentratie in de buitenste zones van de granulerestanten en de aanwezigheid van uitgeloogd AP in de extragranulaire ruimte. Verder werd brood met een lager korstvochtgehalte bekomen wanneer de baktijd toenam. Vervolgens trad vochtmigratie tussen kruim en korst tijdens bewaring in sterkere mate op.Na de intermediaire bewaarperiode werden de broden afgebakken zodat gekristalliseerd AP terug afsmolt. De herverdeling van water die optrad tijdens intermediaire bewaring kon echter niet ongedaan gemaakt worden tijdens deze finale bakfase. Het kruimvochtgehalte van brood bereid met 100 g bloem nam af met 8% tijdens 7 dagen bewaring ten gevolge van kruim naar korst vochtmigratie. In brood bereid met 270 g bloem en bewaard gedurende dezelfde termijn, nam het kruimvochtgehalte met slechts 1% af door de hoge kruim tot korst verhouding. Het kruimvochtgehalte van deze laatste broden bleef dus hoog tijdens intermediaire bewaring. Zodoende volstond het afsmelten van gerekristalliseerd AP om een vers, afgebakken brood te verkrijgen met een kruimhardheid en –veerkracht die vergelijkbaar was met die van vers, voorgebakken brood. In tegenstelling tot wat algemeen wordt aangenomen, verhardde het kruim van dit afgebakken brood bovendien niet sneller dan dat van brood bereid via een conventioneel, enkelvoudig bakproces. Het broodvolume is zeer belangrijk in deze context. Kruim van brood bereid met 100 g bloem droogde namelijk aanzienlijk uit tijdens intermediaire bewaring. Aangezien dit niet ongedaan gemaakt kan worden tijdens afbakken, gaan we ervan uit dat kleiner brood na afbakken wel sneller zal verouderen dan zijn conventioneel gebakken equivalent.Wijzigingen in de zetmeelfractie en de herverdeling van water dragen dus in belangrijke mate bij tot de eigenschappen van vers en bewaard brood. De ‘timing’ van verstijfseling tijdens bakken en de mate van AP-rekristallisatie tijdens bewaring zijn grotendeels afhankelijk van AP-karakteristieken. AM-karakteristieken bepalen het moment waarop en de mate waarin AM-kristallisatie en de ontwikkeling van het AM-netwerk optreden tijdens koelen. Er werd aangetoond dat de herverdeling van water van groot belang is tijdens de broodveroudering, zeker wanneer het om afgebakken brood gaat. De waterherverdeling die plaatsvindt tijdens intermediaire bewaring is namelijk niet omkeerbaar tijdens de finale bakfase. De verworven inzichten over de rol van AM en AP en de hiermee gerelateerde watermobiliteit laten toe de optimale zetmeeleigenschappen in brood te beschrijven. In zulk zetmeel komen de verhouding van AM en AP en de ketenlengteverdeling van AM overeen met deze in normaal tarwezetmeel, terwijl de AP-fractie een aanzienlijke hoeveelheid ketens bevat die te kort zijn om te kristalliseren." "SRP (Zwaartepunt): Hoge-Energiefysica" "Jorgen D'Hondt" "Astronomie en Astrofysica Onderzoeksgroep, Theoretische Natuurkunde, Elementaire Deeltjes, Natuurkunde" "Fundamentele fysische processen betrokken bij de meest energetische verschijnselen in het universum, de aard van donkere materie en de structuur van primarkiaal-gluc plasma met behulp van de CMS-detector in de Large Hadron Collider en buiten dit bereik, de meest energetische deeltjes die uit de kosmos komen, zoals waargenomen door de IceCube-sterrenwacht." "Algorithms for Analyzing Biological Sequences (Algoritmen voor de analyse van biologische sequenties)" "Hendrik Blockeel" "Afdeling Informatica" "In 1995, scientists achieved the first complete genetic map of a free living organism, the bacterium Haemophilus influenzae. Since then, a hugeamount of genomic and proteomic data has been generated due to the developments in biological and computer sciences. This availability of data has led to a new challenge, namely, the analysis and interpretation of this data. These involve many tasks such as: the identification of genes,regulatory regions, and repetitive elements; phylogenetic analysis; identification of proteins and peptides expressedin an organism, cell or tissue; and protein function prediction.In this thesis, we investigate computational methods for analyzing nucleotide and amino acid sequences. We do it in the context of three biological problems: phylogenetic tree reconstruction, protein subfamily identification, and peptide identification using mass spectrometry data.In phylogenetic tree reconstruction, one is interested in inferring the most likely tree topology that explains the evolutionary history of genes and organisms. We propose a method that, given a set of nucleotide or amino acid sequences, builds a phylogenetic tree in a top-down way. Our method is based on a conceptual clustering method that extends the well-known decisiontree learning approach. We start from a single cluster containing all sequences and repeatedly divide it into subclusters until all sequences form a different cluster. We assume that a split can be described by referring to particular polymorphic positions of the multiple sequence alignment and propose a heuristic to choose the best split at each iteration.This allows us to identify important mutations that might have given rise to different evolutionary lineages. The trees generated by our methodare therefore more informative than the ones generated by standard methods. Moreover, we show that our method is comparable to standard ones interms of accuracy of the produced phylogenetic tree.In protein subfamily identification, given a set of sequences belonging to a protein family, the goal is to identify subgroups of functionally closely related proteins. This can be done by using evolutionary information. We propose a method that first uses the phylogenetic tree reconstructionmethod described in the previous paragraph, and then cuts the tree to extract clusters (subfamilies) of sequences. We show that the proposed method yields good results with advantages over those produced by a state-of-the-art method. More specifically, it identifies subfamily-specific positions that might be important for the function(s) associated to the subfamily, and it allows easy classification of new sequences into one ofthe identified subfamilies.Finally, we consider the problem of inferring the peptide identification of mass spectrometry data. Inmass spectrometry, an unknown peptide undergoes fragmentation, and its fragment masses are registered in a fragmentation spectrum. Then, computational methods infer the peptide sequence from its spectrum. We proposea method that does this by searching for the peptide identification in the six-frame translation of the genome. Differently from other methods that allow a similar search, it does not use a filtering procedure to limit the computation of the scoring function to a small subset of sequences that are likely to obtain a high score. Instead, it performs an exhaustive scan of the genome translation. We show that our strategy can identify more peptides than a non-exhaustive search.As an additionalcontribution of this thesis, we consider a problem purely computational, namely, the problem of estimating the certainty of a prediction given by a decision tree. We propose a method that uses a transductive procedure to tackle this task. We show that our method improves the certainty estimates given by standard decision trees, and is especially suitable for ranking estimation. The ideas we use in our method can be easilygeneralized to other machine learning techniques, as well as combined with existing methods for prediction certainty estimation." "Adaptieve directe zoekmethoden voor gradiëntvrije optimalisatie met één of meerdere objectieffuncties" "Wim Desmet" "Mecha(tro)nische SysteemDynamica (LMSD)" "Door de groei van de beschikbare rekenkracht in de voorbije decennia worden numerieke methoden steeds meer toegepast in de ingenieurspraktijk. Geavanceerde computerprogramma’s voor ontwerp en analyse zijn standaardtools geworden. Ook de stand van de techniek in numerieke optimalisatie is gestaag vooruitgegaan. Gezien de nauwe band tussen ingenieurswetenschap en optimalisatie is het geen verrassing dat de beweging naar integratie van krachtige modellerings- en optimalisatiesoftware zich reeds heeft ingezet. De beide domeinen zijn echter nog niet perfect op elkaar afgestemd. Ten eerste gelden typische aannames als afleidbaarheid en transparantie dikwijls niet voor optimalisatieproblemen gebaseerd op numerieke simulaties. Ten tweede is het typisch niet mogelijk om een complex ingenieursprobleem te stellen als een optimalisatie met een enkele doelfunctie.Met het doel de bovenstaande uitdagingen het hoofd te bieden, stelt dit proefschrift nieuwe technieken voor black-box-optimalisatie met één of meerdere doelfuncties voor. De ontwikkelde methoden zijn volledig niet-intrusief, vergen geen expliciete afgeleiden, en zijn robuust tegen problematisch functioneel gedrag zoals numerieke ruis en gefaalde evaluaties. Ze zijn ontworpen voor efficiëntie in termen van black-box-evaluaties en genereren steeds toelaatbare ontwerppunten, zodanig dat restricties op vlak van rekentijd makkelijk opgelegd kunnen worden. De methoden voor meerdere doelfuncties die dit werk voorstelt benaderen het gehele Paretofront, wat een grote hoeveelheid informatie over de afwegingen tussen de verschillende doelfuncties oplevert. Op conceptueel niveau zijn de algoritmen ontworpen om eenvoudig begrepen, geïmplementeerd en gebruikt te worden, ook door niet-experten in numerieke optimalisatie.  De belangrijkste bijdrage betreffende optimalisatie met een enkele doelfunctie is de gradient-informed generating set search (GIGS) methode. GIGS is een directionele directe zoekmethode voor continue optimalisatie met rechtstreeks begrensde ontwerpvariabelen. De methode maakt geen gebruik van expliciete afgeleiden, maar benadert de topografie van de doelfunctie door gedurende meerdere iteraties simplexgradiënten te berekenen. Met behulp van deze informatie worden de zoekrichtingen op een adaptieve manier aangepast, wat leidt tot versnelde convergentie zonder vermindering van robuustheid. In het huidige werk wordt het algoritme eerst duidelijk gedefinieerd en worden de convergentie-eigenschappen bestudeerd. Daarna wordt aangetoond dat GIGS goed presteert in vergelijking met moderne directe zoekmethoden, zowel voor een verzameling academische optimalisatieproblemen als voor een aantal realistische use cases uit de ingenieurswetenschap.Op vlak van optimalisatie met meerdere doelfuncties introduceert dit proefschrift steepest-descent direct multisearch (SD-DMS), een adaptieve directe zoekmethode voor continue optimalisatie met rechtstreeks begrensde ontwerpvariabelen. Net als GIGS benuttigt SD-DMS de specifieke structuur van directionele methoden om simplexgradiënten te bepalen zonder bijkomende functie-evaluaties. Uitgaande van de informatie geleverd door de simplexgradiënt tracht SD-DMS zoekrichtingen te bepalen die alle doelfuncties tegelijkertijd verbeteren. In het laatste deel van dit werk worden de SD-DMS algoritmen beschreven en meerdere strategieën om de totale rekentijd te verminderen aangebracht. Tenslotte worden ook verschillende numerieke tests uitgevoerd, waarin de performantie van SD-DMS vergeleken wordt met andere directe zoekmethoden die de stand van de techniek vertegenwoordigen." "Groen Licht Vlaanderen, stuurgroepvoorzitter." "Geert Deconinck" "Afdeling ESAT - ELECTA, Elektrische Energie en Computerarchitecturen" "Het project ""Stimuleren van energie-efficiënte verlichtingstoestellen en installaties"" is een project in het kader van Thematische Innovatie Stimulering (TIS) van IWT Vlaanderen. Het project heeft als doel het gebruik van en het onderzoek rond energiezuinige verlichting te stimuleren. Het project zal uitgevoerd worden door een consortium dat bestaat een twintigtal bedrijven voornamelijk uit de verlichtingssector en een aantal non-profit organisaties. Dit consortium zal de naam ""Groen Licht Vlaanderen"" krijgen. ""Groen Licht Vlaanderen"" moet het Vlaamse kenniscentrum voor energiezuinige verlichting worden. Belangrijkste doelstellingen:Het promoten van energie-efficiënte verlichtingstechnieken en het zorgen voor een versnelde invoering van veelbelovende technieken. Integratie van veelbelovende technologie in design en vormgeving.Bedrijven ondersteunen in onderzoeksprojecten rond energiezuinige verlichting (technische ondersteuning, partner search, aanvragen van overheidssteun voor innovatieprojecten, begeleiding van innovatieprojecten).Uitbouw van een Vlaams kenniscentrum voor energie-efficiënte verlichting en het versterken van de concurrentie positie van Vlaamse bedrijven op de Europese markt van energie-efficiënte verlichting."