De coöperatie tussen TLX3 overexpressie en WT1 inactivatie in T-cel acute lymfatische leukemie.

T-cel acute lymfatische leukemie (T-ALL) is een agressieve hematologische leukemie die veroorzaakt wordt door de stapsgewijze accumulatie van chromosomale afwijkingen en mutaties. De deregulatie van transcriptionele controle en verstoring van epigenetische homeostase zijn kenmerkend voor deze maligniteit. PRC2 is het epigenetisch complex verantwoordelijk voor het schrijven van H3K27me3, de histonmerker geassocieerd met genrepressie en het behoud van celidentiteit. Tot 25% van T-ALL patiënten draagt inactiverende mutaties in SUZ12, EZH2 en EED, de 3 kerncomponenten van het PRC2 complex. Een gerichte sequenering van 155 T-ALL patiënten uitgevoerd in ons laboratorium, heeft aangetoond dat PRC2 mutaties, en SUZ12 mutaties in het bijzonder, frequenter samen voorkomen met mutaties in de IL7R-JAK-STAT signaaltransductie pathway dan verwacht op basis van toeval.

Om na te gaan of PRC2 inactivatie coöpereert met mutante JAK3 signaaltransductie tijdens de ontwikkeling van T-ALL, hebben we de JAK3(M511I) mutant tot expressie gebracht in muisbeenmergcellen in vivo en het effect getest van Cas9-gemedieerde inactivatie van Suz12 op leukemie ontwikkeling. Hematopoietische stam- en progenitorcellen (HSPCen) afkomstig van transgene muizen die constitutief Cas9 tot expressie brengen, werden gecotransduceerd met een een retrovirale Suz12 gRNA vector met RFP reporter en een JAK3(M511I) vector met GFP reporter. Na injectie van de getransduceerde cellen in recipiënte muizen, werden deze dieren gevolgd door middel van seriële bloedafnamen.

De muizen ontwikkelden een T-cel leukemie die alle hematologische organen infiltreerden. Initieel was de dominante (pre-)leukemische populatie in het bloed was GFP-only (JAK3 M511I)-positief, maar over de tijd werd er een snelle expansie van GFP/RFP dubbel-positieve cellen geobserveerd. Wanneer de muizen opgeofferd moesten worden, was de meerderheid van cellen in het bloed en organen GFP/RFP positief. Verrassend genoeg ontwikkelden muizen geïnjecteerd met Suz12 gRNA-only cellen ook leukemie, dit was echter wel met een langere latentie van 112 dagen vergeleken met 71 dagen bij de JAK3(M511I) + Suz12 gRNA muizen. Deze data zijn een sterke indicatie dat Suz12 inactivatie collaboreert met JAK3(M511I) tijdens T-ALL ontwikkeling.

Momenteel wordt het mechanisme van coöperatie nog onderzocht. Differentiële genexpressie analyse heeft aangetoond dat de meerderheid van genen up-gereguleerd worden na Suz12 inactivatie. Zo zijn er 2300 (96%) genen up-gereguleerd in tegenstelling tot slechts 107 (4%) down-gereguleerde genen wanneer we JAK3(M511I) + Suz12 gRNA- vergelijken met JAK3(M511I)-only leukemie. In Suz12 gRNA-only leukemie versus wildtype thymocyten, 1510 (75%) genen waren up-gereguleerd en 514 (25%) genen waren down-gereguleerd. ChIP-seq analyse heeft onthuld dat genoomwijde H3K27me3 niveaus drastisch gereduceerd waren na Suz12 inactivatie, dit is in overeenstemming met intranucleaire FACS kleuring voor deze histonmerker. Daarnaast hebben we ook individuele loci bekeken die voldeden aan de volgende criteria: gereduceerde binding van Suz12, gereduceerde H3K27me3 niveaus en een toename van hoeveelheid promotermerker (H3K4me3). Onder loci die voldeden aan deze 3 criteria vonden we Hoxa genen (Hoxa1, Hoxa3, Hoxa5) en Notch1 target genen (Hes1, Hes2, Hes7, Hey2, Heyl, Dtx1, Dtx4), deze Notch1 pathway genen zijn van groot belang in T-cel ontwikkeling en in T-ALL.

Deze data tonen aan dat Suz12 inactivatie coöpereert met JAK3-activerende mutaties in de ontwikkeling van T-ALL in vivo. Daarnaast demonstreert het de toepassingsmogelijkheden van transgene Cas9 muizen in de studie van de rol van tumor suppressor genen in T-ALL muismodellen.