Antivirale middelen tegen poliovirus en andere enterovirussen

Een aanzienlijk aantal virussen die behoren tot het genus enterovirus zijn belangrijke humane pathogenen, waaronder poliovirussen (PV), rhinovirussen (HRVs) en enterovirus 71 (EV71). Deze virussen kunnen relatief milde symptomen veroorzaken zoals verkoudheid en huiduitslag maar ze zijn ook de oorzaak van diverse ernstige en levensbedreigende symptomen zoals meningitis, encefalitis, myocarditis en verlamming. Momenteel zijn er geen specifieke antivirale geneesmiddelen beschikbaar die kunnen worden gebruikt om infecties veroorzaakt door enterovirussen te behandelen. De ontdekking en ontwikkeling van enterovirus remmers, evenals de ontwikkeling van methoden en modellen die gebruikt kunnen worden voor de studie van enterovirus replicatie, vormen de belangrijkste onderwerpen van dit proefschrift.

In het laatste stadium van de wereldwijde PV eradicatie campagne, zou men de mogelijkheid willen hebben om patiënten met een chronische PV infectie te behandelen met een antiviraal middel, om zo de uitscheiding van het virus tegen te gaan. Ook zou een dergelijk antiviraal middel gebruikt kunnen worden om potentiële uitbraken van polio te bestrijden, in de periode na afschaffing van het oraal poliovirus vaccin (OPV). Als onderdeel van dit PhD project ontdekten we een nieuw anti-PV molecule “H1PVAT” en beschreven we het werkingsmechanisme. We toonden aan dat het molecule ingrijpt op het beginstadium van de virale replicatiecyclus. Selectie van H1PVAT-resistente PV varianten hebben een I194F aminozuur substitutie in het VP1 capside eiwit. Het resistente virus blijkt daardoor volledig ongevoelig te zijn voor de antivirale werking van H1PVAT. Twee andere reeds eerder beschreven capside bindende anti-enterovirus moleculen, V-073 en pirodavir, zijn ook niet meer actief tegen het H1PVAT-resistente virus. Met een thermostabiliteit experiment werd aangetoond dat H1PVAT het virus beschermt tegen hitte, wat er op duidt dat er een directe interactie is tussen het virale capside en H1PVAT. Deze bevinding werd onderbouwd door een in silico modeleerstudie, waaruit bleek dat H1PVAT het capside bindt op dezelfde plek als V-073 en pirodavir.

Het testen van de potentiële antivirale activiteit tegen EV71 wordt meestal uitgevoerd tegen de willekeurig gekozen prototype stam BrCr; deze is echter niet representatief voor alle genotypen. Daarbij zijn er tegenstrijdige publicaties over de antiviral activiteit van het capside bindende molecule pleconaril tegen EV71; in sommige studies wordt antivirale activiteit gerapporteerd en in andere niet. Wij selecteerden we een panel van 21 EV71 isolaten die representatief zijn voor de verschillende circulerende genotypen en evalueerden de vatbaarheid van deze isolaten voor een aantal enterovirus remmers. De antivirale moleculen die in deze studie werden gebruikt zijn drie capside bindende moleculen, twee protease remmers en een verbinding die gericht is tegen het cellulaire eiwit phospatidylinositol-4-kinase III β, dat essentieel is voor enterovirus replicatie. Er werden geen significante verschillen in antivirale activiteit waargenomen voor elk van deze verbindingen tegen de 21 geteste EV71 stammen. Pleconaril bleek volledig inactief te zijn tegen alle 21 isolaten. Uit een in silico modeleerstudie, waarin de interactie van de drie capside binders pleconaril, vapendavir en pirodavir met het virale capside werd berekend, bleek dat pleconaril een (waarschijnlijk) essentiële waterstof brug met het capside mist. Vanwege het ontbreken van antivirale activiteit tegen EV71 dient pleconaril niet te worden gebruikt om humane EV71 infecties te behandelen.

We beschrijven het werkingsmechanisme van hydantoïne, een anti-enterovirus molecule waarover reeds in 1997 al werd gerapporteerd. Algemeen wordt aangenomen dat hydantoïne de morfogenese van enterovirussen remt. Echter in een experiment waarin we hydantoïne gebruikten als een referentie molecule, verkregen we resultaten die ons het eerder gerapporteerde werkingsmechanisme in twijfel deed trekken. Gebruik makende van infectieus virus, qPCR en replicon experimenten toonden we aan dat naast inhibitie van morfogenese ook de replicatie van viraal RNA geremd door hydantoïne wordt. Hiermee bewezen we dus dat hydantoïne een dubbel werkingsmechanisme heeft.

We identificeerde een nieuwe enterovirus inhibitor genaamd “PHAR193852”. We observeerden dat dit molecuul actief is tegen meerdere enterovirussen, maar het ontbeert activiteit tegen HRVs. PHAR193852-resistente PV1 Sabin varianten werden geselecteerd en elk van deze varianten blijkt een mutatie in het 3A gen en in stam-lus V van de Internal Ribosome Entry Site (IRES) te bezitten. De IRES maakt deel uit van het niet-coderende stuk RNA van het enterovirus genoom. Introductie van de afzonderlijke 3A of IRES mutaties in een PV1 Sabin infectieuze kloon leverde geen resistent virus op. Alleen wanneer beide mutaties gezamenlijk werden geïntroduceerd, blijkt het virus resistent te zijn tegen het antivirale effect van PHAR193852. De mutaties hebben geen invloed op de replicatie efficiëntie van het virus. In tegenstelling tot sommige andere antivirale moleculen die de identieke resistentie mutaties in 3A selecteren, is PHAR193852 geen remmer van phospatidylinositol-4-kinase III β (PI4KIIIβ) en oxysterol-binding protein (OSBP). Het precieze moleculaire werkingsmechanisme van PHAR193852 dient nog verder te worden onderzocht.

Om de werkzaamheid van nieuwe EV71 remmers te kunnen evalueren in een relevant diermodel ontwikkelden we een EV71 infectie model in SCID muizen. De SCID muizen worden geïnfecteerd met ofwel de EV71 stam #812 (genogroep C2) of de muis-geadapteerde variant (#812/MA) die we voor dit model genereerden. Beide virus stammen resulteerden in verlammingsverschijnselen van de achterste poten bij de geïnfecteerde SCID muizen. Echter, de verlammingsverschijnselen ontstonden bij de muizen die waren geïnfecteerd met stam #812 11 dagen later dan bij muizen die waren geïnfecteerd met identieke hoeveelheid van het muis-geadapteerde virus. Gebruik makende van qPCR werd door ons aangetoond dat EV71 #812/MA al enkele dagen na de infectie in grote hoeveelheden aanwezig was in de hersenen en ruggenmerg van de muizen, wat er op duidt dat het virus neurotroop is. Daarentegen repliceert EV71 #812 de eerste dagen na infectie vooral in de longen en wordt pas op een later tijdstip neurotroop, terwijl stam #812/MA veel minder in de longen repliceert. Met behulp van immuunhistochemie toonden we aan dat vooral de motorneuronen geïnfecteerd worden door het virus, wat de verlammingsverschijnselen verklaart.

Virus dat werd geïsoleerd uit het centraal zenuw stelsel (CNS) van EV71 #812 geïnfecteerde SCID muizen bezit een V135I aminozuur substitutie in VP2 (in vergelijking met het gebruikte inoculum) maar in virus geïsoleerd uit ander weefsel is deze substitutie niet aanwezig. Isoleucine 135 in VP2 bleek reeds aanwezig in de muis-geadapteerde en meer neurovirulente inoculum stam #812/MA. Dit aminozuur, dat zich aan de buitenkant van het capside bevindt, is derhalve zeer waarschijnlijk verantwoordelijk voor de neurovirulentie en het neurotropisme van EV71 in (SCID) muizen. Vervolgens bestudeerden we de gen en eiwitexpressie van de twee beschreven EV71 receptoren, SCARB2 en PSGL-1, in tien verschillende typen weefsels (met behulp van qPCR en immuunhistochemie). We toonden geen relatie aan tussen de weefsel expressie van deze receptoren en het geobserveerde EV71 tropisme.

Het oorspronkelijke doel van het ontwikkelen van dit muismodel was om de mogelijkheid te hebben om de werkzaamheid van moleculen met in vitro anti-EV71 activiteit in een relevant in vivo model te evalueren. Om dit model te valideren voor antivirale studies wilden we de werkzaamheid van de krachtige 3C protease remmer rupintrivir aantonen in het model. Er bleek echter dat het middel geen bescherming biedt tegen EV71-geinduceerde pathologie. Zeer waarschijnlijk kan het molecule niet in een voldoende hoge concentratie het CNS binnendringen om virale replicatie te remmen. Deze observatie onderstreept dus het belang van een relevant in vivo infectie model.