Gepollueerd ecosysteem voor het "mijnen" en karakteriseren van enzymatische functies.

De afgelopen decennia heeft het intensief en wijdverspreid gebruik van pesticiden ertoe geleid dat onze water- en bodemecosystemen met deze xenobiotische en persistente stoffen zijn verontreinigd. Desondanks de relatief recente introductie van pesticiden in ons milieu is aangetoond dat micro-organismen nieuwe katabolische routes kunnen creëren die in staat zijn specifieke xenobiotica af te breken. Dat micro-organismen zich snel kunnen aanpassen aan veranderende milieuomstandigheden, en hierbij nieuwe ecologische niches kunnen exploiteren, vloeit voort uit hun grote genoomplasticiteit. Een essentieel mechanisme in deze bacteriële genoomplasticiteit is de intra- en extracellulaire uitwisseling van genetisch materiaal, dat gefaciliteerd wordt door het collectief van mobiele genetische elementen (MGEs), het zogenaamde mobiloom. Genomische studies van xenobiotische degradeerders toonden aan dat twee specifieke MGEs, namelijk IncP‑1 plasmiden en IS-element IS1071, vaak worden teruggevonden met accessoire genen die xenobiotica katabole functies bevatten. Daarom kan worden verondersteld dat IncP-1 en IS1071 een cruciale rol spelen bij de mobilisatie en rekrutering van xenobiotica katabole genen binnen ecosystemen. Er is echter niet veel bekend over hun ecologie binnen bacteriële gemeenschappen, noch over de adaptieve genen die zij binnen dergelijk complexe gemeenschappen dragen.

Het doel van dit proefschrift is om de rol van IS1071 en IncP-1 in de verspreiding van katabole genclusters in het microbioom van met pesticiden verontreinigde omgevingen verder te verhelderen. Meer bepaald werd het voorkomen van deze MGEs in microbiomen van verschillende ecosystemen bestudeerd en werden moleculaire toolboxen ontwikkeld om hun accessoire genen te bestuderen. De bestudeerde ecosystemen omvatte biopurificatiesystemen (BPS) die pesticiden verontreinigd afvalwater verwerken op landbouwbedrijven en landbouwbodems.

De eerste doelstelling bestond erin om een verband tussen de aanwezigheid van IncP‑1/IS1071 en pesticiden verontreiniging aan te tonen. Daartoe werd de prevalentie en abundantie van IncP-1-plasmiden en IS1071 onderzocht in zowel microcosm en natuurlijke ecosystemen met en zonder blootstelling aan pesticiden. Microcosm experimenten met BPS en landbouwbodem matrix suggereerden dat zowel de aanwezigheid van IncP-1 als IS1071 sterk toeneemt als reactie op blootstelling aan pesticiden. En dat deze toegenomen prevalentie ook gepaard gaat met toename van de afbraakcapaciteit van pesticiden. Ook op operationele BPS van landbouwbedrijven werden hoge aanwezigheid van beide MGEs vastgesteld samen met de capaciteit om een breed scala aan pesticiden en gechloreerde aromatische componenten te degraderen of te metaboliseren. Daarentegen werden in andere ecosystemen zonder gekende pesticidehistoriek IncP‑1 plasmiden en IS1071 minder talrijk teruggevonden, hoewel sommige uitzonderingen net hoge IS1071-abundaties vertoonden. Deze data suggereren dat er een verrijking optreedt aan micro-organismen die IS1071 en IncP‑1 bevattende in met pesticiden verontreinigde omgevingen, zoals BPS, en deze mogelijks bijdragen aan de verspreiding van katabole genen en aan de creatie van nieuwe katabole reactiepaden.

Om de ecologische rol van deze twee MGEs verder te ontrafelen, werden nieuwe cultivatie-onafhankelijke toolboxen, gebaseerd op long-range PCR, ontwikkeld die toelaten om accessoire genen gelegen op IS1071 samengestelde transposons en IncP‑1 plasmiden op te pikken zonder cultivatie van de bacteriële gastheren. Hiervoor werd een long-range PCR-methode ontwikkeld waarbij de accessoire genen gelegen tussen twee IS1071-kopieën uit DNA-isolaten van omgevingsstalen konden worden geamplificeerd en vervolgens gesequeneerd. Deze methode werd zowel toegepast op stalen die bloot werden gesteld aan pesticiden, zoals met linuron behandelde landbouwbodems en operatieve BPS van een landbouwbedrijf, als op onbehandelde controle stalen. Amplicons werden voornamelijk teruggevonden in stalen met een pesticidenhistoriek, waarbij ook een grotere diversiteit aan amplicons werd geobserveerd bij de BPS-matrix ten opzichte van de landbouwbodem. Genfuncties op deze amplicons toonde ook een weerspiegeling van de selectiedruk door de pesticiden, aangezien (i) een groot deel van de BPS amplicons genen/genclusters bevatte die in verband kon worden gebracht met de afbraak van organische stoffen, waaronder herbiciden, (ii) in de landbouwgrond de genen teruggevonden werden die instaan voor de degradatie van linuron. Onze metagenomische analyse staaft eerdere bevindingen met bacteriële isolaten, door aan te tonen dat IS1071 een drager is van katabole genen in ecosystemen gecontamineerd met xenobiotische componenten en bijdraagt aan de adaptatie van de bacteriële gemeenschap richting biodegradatie van xenobiotica.

Een gelijkaardig long-range PCR-methode werd ontwikkeld om de accessoire genen van IncP‑1-plasmiden rechtstreeks uit omgevingsstalen te isoleren en te identificeren. Op IncP-1 plasmiden bevinden accessoire genen zich in specifieke genomische regios, waarvan een belangrijke accessoire regio gelegen is tussen de essentiële genen trbP en traC. Amplificatie van deze genregio in combinatie met sequenering laat toe deze te bestuderen en werd toegepast op DNA-isolaten van een operatieve BPS van een landbouwbedrijf. Tegen de verwachtingen in werd slechts een klein aantal katabole degradatiefuncties geïdentificeerd en werden er daarnaast een grote diversiteit van gekende en ongekende genfuncties teruggevonden, waaronder resistentiemechanismen. Deze resultaten wijzen erop dat de IncP-1 accessoire regio gelegen tussen trbP en traC slechts een beperkte bijdrage levert aan de katabole adaptatie van het aanwezig microbioom van het BPS. In plaats daarvan wordt een grote functionele diversiteit van genen de teruggevonden die mogelijks een ondersteunende functie hebben voor de biodegradatie, co-geselecteerd worden met katabole genen gelegen in andere accessoire regios, of andere essentiële functies bieden voor proliferatie in de BPS-ecosystemen.

Deze data ondersteunen de hypothese dat IS1071 en IncP-1 gekoppeld zijn aan xenobiotische afbraak in omgevingen blootgesteld aan pesticiden en dat voornamelijk IS1071 een belangrijk MGE is voor het verspreiden van xenobiotica katabole genfuncties. Om de volledige rol van IS1071 en IncP-1 in bacteriële adaptatie te begrijpen en het type genfuncties die ze verspreiden binnen microbiële gemeenschappen, is het essentieel om verschillende ecosystemen met verschillende milieustressoren te bestuderen.